摘要

在全球範圍內，有數百萬婦女早產或新生兒過小。需要有效的生物標記物來確定有這些不良結果風險的婦女。在以前的研究或試驗中收集的樣本中檢測其他代謝物的任何潛在的新生物標誌物，一種時間和成本效益的方法將非常有用。因此，目前的研究旨在確定之前解凍和重新冷凍的樣本是否可以重新檢測新的生物標誌物，這些標誌物包括脂蛋白組成(大小、蛋白質組、脂類)和組合膽固醇和細胞因子濃度。收集51名年輕的非孕婦的空腹血，並在低溫或室溫多次冷凍/解凍循環後和儲存18個月後分析血漿的脂蛋白組成和細胞因子濃度。血漿LDL-C、HDL-C、總膽固醇和甘油三酯濃度在低溫解凍7次、室溫解凍3次和儲存18個月後下降<6-7%(膽固醇)或<20%(甘油三酯)。由於這些下降低於每天報告的脂類變化，它們似乎在生理上不顯著。細胞因子(IL-6、TNF α、IL-8、IL-1β)和hsCRP濃度分別下降22%、8%、8%、22%和35%;隻有IL-6、IL-1β和hsCRP濃度顯著下降，高於20%的日變化。對於測量到的甘油三酯和細胞因子，而不是膽固醇濃度，當濃度升高時，隨凍融循環下降的幅度更大。 Multiple thaws also led to changes in lipoprotein sizing, specifically to a shift from medium- and large-sized HDL particles to small-sized HDL particles and from large LDL to IDL. No changes occurred for VLDL particle numbers. Though particle sizes changed, the HDL proteome did not change with multiple thaw cycles or after long term storage. Overall, the results demonstrate that it is possible to use previously obtained frozen samples for plasma cholesterol and triglyceride levels and the lipoprotein proteome, and lipoprotein sizing and cytokine concentrations if one knows the history of the sample as changes should be relative to one another.

關鍵字

膽固醇;細胞因子;脂蛋白上漿;高密度脂蛋白蛋白質組;載脂蛋白-ⅰ;早產;低出生體重

簡介

需要新的生物標記物來識別有不良妊娠結局風險的婦女，包括那些出生體重低(LBW)或出生早產(早產;PTB)。事實上，全世界每年出生的低體重嬰兒超過2200萬，患肺結核的嬰兒超過1500萬[1,2]。對有不良妊娠結局風險的婦女進行先發製人的識別，可使高危婦女成為監測或幹預措施的目標，以改善結局。在資源匱乏的環境中尤其如此，在這些環境中，大多數患有LBW或PTB的嬰兒出生[1,2]，而且醫療幫助也不容易獲得。雖然已知有影響胎兒生長的因素(營養、胎盤功能)和早產(宮頸長度、以前的早產、懷孕間隔)，但仍有許多新生兒有先天性LBW或PTB的原因。事實上，在過去的五年裏，Pub Med上有超過800篇文章評估早產的潛在生物標誌物，超過350篇文章評估低出生體重嬰兒的潛在生物標誌物。

盡管之前的許多研究已經將母體循環中的細胞因子作為早產或低出生體重兒的潛在生物標誌物，但隻有不到50篇文章介紹了母體脂肪水平，隻有一篇文章研究了脂蛋白大小或脂蛋白蛋白質組，這是目前代謝脂質紊亂和疾病狀態的最佳指標[3-5]。令人驚訝的是，更多的研究沒有尋找膽固醇和不良妊娠結局之間的潛在關係，因為膽固醇是雌二醇和孕酮的前體，是每個膜的關鍵成分，集中在膜的部分，細胞內信號經常產生。同樣，脂蛋白是脂質(如膽固醇)和許多具有代謝活性的蛋白質(如具有抗炎功能的蛋白質)在組織之間運輸的途徑。在為數不多的檢查產婦膽固醇和不良妊娠結局的研究中，包括陽性、陰性或無關聯。因此，這可能不是一個簡單的產婦膽固醇或脂質水平的測量，而是脂蛋白組成或各種導致不良結果的因素的組合。例如，最近有人假設，隻有結合[6]時，產婦脂蛋白-膽固醇和細胞因子濃度(低HDL-C和高tnf - α濃度)才是早產的生物標誌物。

檢測以前收集的樣本的能力將是一種非常時間和成本效益的方法，以檢測任何新發現的生物標誌物是否與不良妊娠結局相關。由於脂蛋白蛋白質組是脂蛋白功能和疾病過程的一個相對較新的標記物，沒有研究確定脂蛋白組成(大小、蛋白質組、脂質濃度)是否隨著多次冷凍/解凍循環而變化。同樣地，使用當前的Multiplex係統和在相同條件下用於研究多次冷凍/解凍循環後的脂蛋白組成的冷凍/解凍的影響是未知的。因此，本研究的目的是確定以前收集和分析的各種代謝因子的樣本是否可以重新測定脂蛋白組成和/或細胞因子。獲得的結果可以應用於任何對脂蛋白組成和/或細胞因子水平感興趣的研究，而不僅僅是關注不良妊娠結局的研究。

研究設計與方法

人類參與者:在辛辛那提兒童醫院醫療中心(CCHMC)的臨床轉化研究中心(CTRC)，從51名18-44歲的健康非懷孕年輕女性中收集了多達30毫升的血液。齋戒一夜後采集血液，血漿立即分離。血漿被混合，因此每次試驗和每次解凍都有一個單獨的試管(見圖1)。對於脂蛋白大小和高密度脂蛋白蛋白質組，來自8名婦女的血漿被合並得到6個樣本。所有樣品置於-80°C冰箱中。在冷環境中解凍的樣品被放置在冷藏室中管旋轉器上的架子上，直到樣品解凍;樣品解凍時間為2 ~ 3小時。在室溫下解凍的樣品放置在室溫水浴中直到解凍，時間不超過30分鍾。完全解凍後，將樣品放回冷凍室，直到下一次解凍。最後的解凍以運行試驗的典型方式發生。因此，在低溫下解凍的樣品有多達7次解凍，在室溫下解凍的樣品有3次解凍。這種方法被用於血漿代謝產物通常在寒冷或冰上解凍，但有時在室溫下快速解凍。 These samples were assayed within 2-5 months of collection. One set of tubes was left in the freezer for 18 months prior to analysis. The collection and use of samples were approved by the Institutional Review Board (IRB) at the University of Cincinnati.

圖1:樣品在室溫或低溫下解凍和再凍結方案。最後的解凍是在每種典型試驗的條件下進行的

血漿脂蛋白膽固醇和甘油三酯濃度

在羅氏/日立Cobas c係統自動分析儀(羅氏診斷，印第安納波利斯，IN)上使用羅氏試劑分析血漿中ldl -膽固醇(LDL-C)、hdl -膽固醇(HDL-C)、總膽固醇和甘油三酯水平。LDL-和HDL-C分別用第二代和第三代測定法[7]直接測定。實驗在CCHMC的生物化學中心進行。

血漿細胞因子濃度

采用Milliplex酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品上清中細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、tnf - α)濃度^TM多路複用套件(Millipore, Billerica, MA)。檢測在CCHMC的細胞學核心中進行。低於檢出限的樣品被指定為0.03 mg/L(最低檢出限和0之間的中間)。

血漿hsCRP濃度

樣品上清液中的hsCRP濃度由Cal生物技術公司(Cal biotech, El Cajon, CA)的超靈敏酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定。檢測在CCHMC的細胞學核心中進行。值過高的樣品被指定為40 mg/L，低於檢測值的樣品被指定為0.03 mg/L。

血漿apoA-I濃度

采用Mabtech公司生產的ELISA法檢測樣品中dpo A-I (dpo A-I)的含量。任何值為>4.5 mg/ml的樣品都不包括在分析中，因為這個值是常規重測的;9名參與者的樣本未用於分析。

脂蛋白分級

用質子核磁共振波譜分析脂蛋白顆粒的樣本用幹冰運送到NIH。根據不同脂質甲基核磁共振信號的振幅，計算不同大小脂蛋白的顆粒濃度[8,9]。加權平均脂蛋白顆粒大小是由每個亞類的直徑乘以基於甲基核磁共振信號振幅的相對質量百分比的總和得出的。

高密度脂蛋白蛋白質組學

解凍冰凍血漿，分離出非apob含脂顆粒，主要由HDL組成;因為在[10]超離心過程中，已知HDL蛋白組丟失，所以沒有通過超離心分離出HDL。用水矽酸鈣(脂質去除劑，LRA)[11]從脂質結合蛋白中分離出無脂質蛋白。脂結合蛋白用胰蛋白酶消化一夜，準備質譜如所述[12]。

統計數據

數據顯示為每個參與者的脂質、apoA-I和細胞因子濃度的單獨測量。收集血漿進行一些試驗，每個收集的樣本用於脂蛋白分級和HDL蛋白質組學。為了達到正態性並方便地解釋影響的比率，對對數轉換值進行重複測量方差分析，並將結果反變換到原始尺度(即，重複解凍的影響表示為比率及其置信區間的估計)。除了18個月的樣本外，所有的數值都與第一次在寒冷中解凍進行比較。由於這些樣品使用不同的試劑進行分析，我們將這些數據與對數轉換值後的配對t檢驗在第一次解凍中獲得的數據進行比較。我們沒有采用傳統的零假設檢驗(檢驗比率是否等於1)，原因有二。首先，一些端點顯示非常小的個體內部變異(變異係數小)，所以條件之間的差異可以被證明是非零的，但小到在科學上不重要，如下所定義。相反，當變化很大時，比率的置信區間很寬，因此既不能排除零效應也不能排除實質性效應(可能的第二類錯誤)。為了緩解這些問題，我們認為膽固醇、LDL-C和HDL-C濃度大於6%、7%或6%或甘油三酯或細胞因子濃度大於20%的差異具有科學意義[13-15]。對於有多個大小或蛋白質組測量的集合樣本，我們使用了傳統的統計數據，這些統計數據最初沒有對分析的蛋白質數量進行調整，然後使用Bonferroni校正進行多次測試調整，並且沒有進行對數轉換。 All averaged data are presented as means ± SD.

結果

每個參與者解凍樣本的血漿甘油三酯和脂蛋白-膽固醇濃度如圖2所示，平均值見表1。有趣的是，在第二次解凍時HDL-C濃度下降了0.3 mg/dl，第三次解凍時LDL-C濃度下降了0.7 mg/dl，總膽固醇濃度下降了1.1 mg/dl，第四次解凍時甘油三酯濃度下降了3.1 mg/dl，就出現了統計學上的顯著差異。與低溫解凍相比，室溫解凍的效果甚微。在7次低溫解凍後，LDL-C、HDL-C、總膽固醇和甘油三酯濃度分別下降了3.5±0.5、2.2±0.2、4.5±0.7和8.6±1.1%，影響最大。儲存18個月後，所有脂類的濃度與原始時間解凍的樣品沒有差異。從第一次解凍到第7次解凍，LDL-C、HDL-C和總膽固醇的10個最高值和10個最低值的參與者的測量濃度下降相似(所有的比較都在4%以內)。然而，血漿甘油三酯濃度最高的10個值比最低的10個值(0.4%)下降更大(14.7%)。

圖2:低溫(左圖)或室溫(右圖)多次解凍後的血漿脂質濃度。我們從51名18-44歲的健康年輕女性身上采集了禁食的血液樣本。在低溫解凍1、2、3、4或7次和室溫解凍1或3次的各等分中測定總膽固醇(A, B)、LDL-C (C, D)、HDL-C (E, F)和甘油三酯(G, H)濃度。每個點代表一個單獨的參與者。

解凍
測量	1	2	3.	4	7	1	3.	1
(冷)						(RT)		(18金屬氧化物半導體)
脂質(mg / dl)
低密度	94.3±29.0	93.7±29.3	93.2±29.1*	92.9±29.0*	90.8±27.8*	93.9±29.1	93.3±28.9	93.8±29.7
高密度脂蛋白膽固醇	61.1±18.2	60.5±18.4*	60.1±18.3*	59.9±18.3*	58.9±17.9*	60.3±18.1	59.9±18.1	64.7±19.4
TC	178.5±38.0	178.2±38.6	176.8±38.1*	176.8±37.7*	174.1±36.6*	177.7±38.0	177.1±38.2	170.8±35.8
TG	91.9±43.2	91.8±41.5	90.0±39.3	88.5±39.0*	83.4±34.4*	91.5±42.6	88.6±39.4	84.7±37.9
細胞因子(pg / ml)
il - 6	2.7±3.8	2.3±3.2*	2.5±5.0*	2.4±3.1*	2.0±2.5*Ψ	2.6±4.2*	2.5±2.9*	2.0±3.8*
腫瘤壞死因子α	14.8±14.3	13.3±9.5*	12.8±9.3*	13.7±10.6	13.1±10.7*	13.9±14.7	13.6±12.7	12.3±4.3
引發	7.4±8.0	6.8±5.7	6.8±6.1*	7.1±65.9	6.8±5.4*	7.0±6.5	7.2±5.9	9.8±13.4
il - 1β	4.6±17.8	4.3±19.4	3.2±11.5*	3.9±15.7*	3.6±15.5* Ψ	4.4±19.8	7.5±41.9	2.1±7.4*
hsCRP(毫克/升)	7.1±10.6	6.4±9.4*	6.1±8.4*	6.1±8.5*	5.6±7.9* Ψ	5.5±6.9*	4.7±6.4*	10.7±14.5*
apoA-I(毫克/毫升)	1.5±0.6	1.3±0.5*	1.3±0.8	1.3±0.6*	1.3±0.7*	1.4±0.9*	1.5±0.9	2.1±0.7*

表1:在低溫或室溫多次解凍和長期儲存後，測定血漿中脂質、細胞因子、hsCRP和apoA-I的水平。
數據以51名個體參與者的平均值±標準差表示。*表示與第一次解凍差異有統計學意義(P<0.05)。Ψrepresents根據先前報道的脂質、細胞因子和hsCRP濃度的每日變化，在生理學上與第一次解凍不同的值。比較冷融期、首次冷融期與室溫解凍期、首次冷融期與保存18個月的樣品解凍期。

血漿細胞因子和hsCRP的測量值也隨著凍融循環發生顯著變化(圖3和表1)，並且比脂質變化更大。隨著凍融循環，所有炎症標誌物的濃度均顯著降低，但在室溫下解凍時影響較小。TNF α和IL-8的濃度變化小於20%的日變化，到第7次解凍時分別為8%和8%，而IL-6、IL-1β和hsCRP的濃度在第7次解凍時分別下降了22、22和35%。貯藏18個月後，IL-8、TNF α濃度變化不大，IL-6、IL-1β濃度明顯下降。與其他因素不同，hsCRP濃度在儲存18個月後增加。盡管受試者看起來是健康的，但有5名受試者的hsCRP升高，高到無法測量，因此濃度設置為40 mg/L，兩名IL-1β、IL-6、TNF α和IL-8受試者在初始解凍時測量值過高。當我們從平均值中去除hsCRP值時，5次低溫解凍和2次室溫解凍的新平均值分別為3.8±5.4、3.4±4.8、3.5±5.1、3.4±5.0、3.2±4.9、3.4±5.1和2.6±4.5 pg/ml。當兩個參與者值最高的細胞因子被移除,新的平均il - 6分別為2.2±2.2、2.0±2.4、1.9±2.0、2.1±2.4、1.9±2.4、2.1±2.3、2.2±2.3 pg / ml,腫瘤壞死因子α是12.0±3.7,11.6±3.7,11.8±3.7,11.4±3.3,11.3±3.4,11.5±3.8,對引發分別為6.4±3.4,6.2±3.4,6.1±3.4,6.5±3.8,6.2±3.6,6.2±3.4,6.6±3.7 pg / ml,和il - 1β分別為1.3±1.7、1.2±1.4、1.1±1.5、1.2±1.6、1.1±1.6、1.1±1.3、1.2±1.8 pg / ml,分別為5次低溫和2次室溫解凍。

ApoA-I濃度見圖4和表1。與其他參數一樣，在低溫條件下多次解凍時，濃度在統計上有顯著下降(下降13%)，但在室溫條件下三次解凍時變化不大。貯藏18個月後，apoA-I濃度增加了40%，在最初濃度最高的樣品中增幅最大。在多次解凍過程中發生的最顯著的生理變化可能是脂蛋白大小的變化。一次或兩次解凍對脂蛋白的大小幾乎沒有影響。然而，經過3次冷凍/解凍後，中、大型高密度脂蛋白顆粒的數量減少，而小型高密度脂蛋白顆粒的數量則增加了近一倍(圖5和表2)。有趣的是，室溫下的三次解凍對尺寸幾乎沒有影響，長期儲存也沒有影響。LDL顆粒的大小也隨著大LDL的減少和IDL的增加而變化(圖6和表2)。凍融循環對VLDL顆粒的大小幾乎沒有影響(圖7和表2)。

圖3:低溫(左圖)或室溫(右圖)多次解凍後的血漿細胞因子濃度。示例與圖1中的相同。在低溫解凍7次或室溫解凍3次的各等份中測定hsCRP (A, B)、TNFα (C,D)、IL-6 (E, F)、IL-8 (G, H)和IL-1β (I, J)。每個點代表一個單獨的參與者。需要注意的是，有兩名參與者的某些細胞因子值過高，不在圖表上;未顯示的IL-1β的濃度為49、23、82、32和18 pg/ml(參與者A)和117、136、76、106和108 pg/ml(參與者B)， IL-6的濃度為24、17、32、16和6 pg/ml(A)， tnf - α的濃度為74、45、56、48和26 pg/ml(A)和88、64、52、73和81 pg/ml(B)。

圖4:在低溫(左圖)或室溫(右圖)多次解凍後的ApoA- I濃度。示例與圖1中描述的相同。在低溫解凍7次或室溫解凍3次的各等分中測定ApoA-I。每個點代表一個單獨的參與者。

圖5:圖1中描述的樣品中HDL粒子數和平均HDL大小在低溫(左麵板)或室溫(右麵板)中多次解凍。每個數據點代表圖1中所述的參與者的血漿(共8個樣本)。通過核磁共振測量高密度脂蛋白總粒子數(A, B)和小高密度脂蛋白(C, D)、中高密度脂蛋白(E, F)和大高密度脂蛋白(G, H)的粒子數。還測定了HDL顆粒的平均大小(I, J)。

圖6:圖5中所示的混合樣品中的LDL顆粒計數和平均LDL大小在低溫(左圖)或室溫(右圖)中多次解凍。通過核磁共振測量總LDL顆粒計數(A, B)和小LDL (C, D)、大LDL (E, F)、超大LDL (G, H)和IDL的顆粒計數。同時測定LDL顆粒的平均大小(I, J)。

圖7:圖5所示的混合樣品中VLDL顆粒計數和平均VLDL大小在低溫(左圖)或室溫(右圖)中多次解凍。通過核磁共振測量VLDL總顆粒計數(A, B)和小VLDL (C, D)、中VLDL (E, F)和大VLDL (G, H)的顆粒計數。還測量了VLDL顆粒的平均大小(I, J)。每個數據點代表圖6中描述的參與者的血漿。

解凍
測量	1	2	3.	4	7	1	3.	1
(冷)						(RT)		(18金屬氧化物半導體)
脂蛋白核磁共振
高密度脂蛋白
粒子#	35.4±1.9	35.5±2.0	35.2±2.3	35.0±2.5	33.7±1.3*	34.7±2.1	36.1±2.3	35.0±2.2
平均尺寸(nm)	10.0±0.2	9.9±0.2	9.9±0.2	9.9±0.2	9.9±0.2	10.0±0.1	9.9±0.2	10.0±0.2
小HDL (#)	6.9±4.7	9.9±2.8	10.1±3.0*	12.5±4.0*	12.1±3.7*	7.4±5.0	8.2±4.5	10.7±3.2
高密度脂蛋白(#)	18.7±4.1	15.8±3.6	15.4±3.8	12.9±3.7*	12.3±4.2*	17.6±4.9	17.9±4.6	14.8±2.7*
大型HDL (#)	9.6±1.3	9.2±1.6*	9.1±1.7*	9.1±1.8*	8.5±1.6*	9.2±1.5	9.5±1.4	9.1±1.6
低密度脂蛋白
粒子#	834±159	842±191	845±185	845±198	761±140	767±126	817±170	818±166
平均尺寸(nm)	20.8±0.4	20.9±0.4	20.8±0.2	20.6±0.3	20.8±0.4	20.7±0.3	20.8±0.4	20.8±0.3
低密度脂蛋白(#)	248±194	252±240	255±191	288±177	261±162	242±122	207±122	202±179
大LDL (#)	396±153	393±148	322±72	238±135*	195±124*	285±106	338±136	326±113
非常大的LDL (#)	914±148	991±160	983±170	920±184	895±137	864±117	932±139	907±158
IDL (#)	116±55	122±95	182±84	234±127*	228±57*	163±47	200±81	222±87*
VLDL
粒子#	41.0±7.3	48.1±6.1	42.0±9.2	40.1±11.9	37.7±10.6	37.9±8.1	41.6±4.1	40.5±11.0
平均尺寸(nm)	49.1±2.1	47.2±1.7	48.7±2.1	50.1±2.3	50.5±2.2	50.6±2.2	49.1±1.4	49.8±1.8
小VLDL (#)	27.1±9.0	33.7±3.3	26.2±9.1	26.8±8.4	28.7±8.4	23.4±3.2	28.6±4.4	24.7±6.5
中VLDL (#)	14.4±9.2	14.5±5.3	16.3±5.1	13.8±4.2	9.6±2.0	15.4±5.0	13.2±3.4	14.2±4.5
大VLDL (#)	2.7±0.4	3.0±1.2	2.9±0.8	2.8±0.6	2.7±0.8	3.0±1.0	3.1±1.1	2.7±0.8

表2:低溫或室溫多次凍融循環和長期儲存後脂蛋白顆粒的數量和大小。
6個樣本的數據以均數±標準差表示。*表示與第一次冷融有顯著差異(P<0.05)。比較冷融期、首次冷融期與室溫解凍期、首次冷融期與保存18個月的樣品解凍期。

最後，用質譜法測定了載脂蛋白b缺失的含脂顆粒(主要由HDL組成)的蛋白質組，共顯示出86個不同的肽。我們分析了排名前40位的多肽，因為這些蛋白質在所有樣本中都一致存在。最豐富的載脂蛋白的肽計數見圖8和表3。ApoA-I是肽數最多的載脂蛋白，是補充C3的第二多的載脂蛋白;由於血液中白蛋白含量較高，樣品中也存在白蛋白。解凍和再冷凍對apoA-I和其他載脂蛋白(包括apoA-IV、apoA-II和apob - iii)的相對含量沒有影響。在數量最多的40個多肽中，隻有2個在多次解凍時略有減少，纖維蛋白原α鏈和纖維蛋白原β鏈，如果不調整比較數量(分別為10.0±2.0到6.0±2.4和8.8±1.0到5.0±1.9在第一次和第七次解凍之間)。當對比較數量進行調整時，解凍對蛋白質組沒有影響。

圖8:與HDL相關的與脂質代謝相關的蛋白質(載脂蛋白)或隨凍融周期改變的蛋白質(纖維蛋白原)的肽數;在不同參與者的HDL顆粒上檢測到多達86種不同的蛋白質。通過質譜儀測定了在低溫下解凍7次(左)和室溫下解凍3次(右)的樣品中apoA-I (A, B)， apoA-IV (C, D)， apoA-II (E, F)， apob - iii (G,H)和纖維蛋白原(I, J)的肽計數。每個數據點代表來自參與者的血漿池，如圖5所示。

	解凍
蛋白質	1	2	3.	4	7	1	3.
(冷)						(RT)
補體C3	43±8	43±7	43±10	42±12	45±6	40±11	40±11
維生素D 英國石油公司	11±3	10±4	10±4	12±3	11±3	11±4	11±4
纖維蛋白原α 鏈	10±2	8±1	8±2	8±2	6±2*	8±2	8±2
纖維蛋白原β 鏈	9±1	8±2	7±2	7±2	5±2*	6±2	7±1
apoA-I	32±5	29±7	27±9	30±5	30±9	31±2	31±3
apoA-IV	12±3	12±2	11±3	11±2	10±3	9±4	12±1
apoA-II	7±1	7±2	7±1	7±2	7±1	8±1	7±1
apoC-III	2±0	2±0	2±1	2±0	2±1	2±0	2±0

表3:在低溫和室溫多次解凍後HDL蛋白組中不同蛋白質的肽數呈現出肽數無變化、肽數下降和肽數最高的載脂蛋白。在剩下的32種蛋白質中，沒有一種隨凍融循環而改變。數據以平均數±標準差表示。*表示多次解凍與寒冷中首次解凍之間的顯著差異(P<0.05)，未校正比較的倍數。當校正比較的蛋白質數量時，沒有蛋白質與第一次在寒冷中解凍時不同。

討論

大量的研究已經檢驗了各種代謝物作為不良妊娠結局生物標誌物的能力。如果能夠返回並分析這些存儲的樣本，以尋找LBW或PTB嬰兒或其他疾病狀態的新的潛在生物標誌物，將非常節省時間和成本，並可能導致更快的幹預或檢測方法。當前研究的目的是確定在檢測新的生物標誌物時，樣品解凍多次是否仍能產生與生理學相關的結果。這是第一份顯示冷凍/解凍循環對新的生物標誌物脂蛋白大小和脂蛋白蛋白質組的影響的報告。這不是第一個研究凍融循環對血漿脂質或細胞因子濃度影響的報告，甚至有報道總結了以前的研究數據[16- 21]。然而，之前的研究都沒有比較多次解凍對低溫和室溫下脂質和炎症因子濃度的影響。許多人也沒有對當前的檢測方法進行評估。

與之前的研究不同，我們發現冰凍/解凍循環對血漿膽固醇和甘油三酯濃度沒有影響，但由於51名參與者的重複測量的高精度，我們發現所有血脂濃度在冰凍/解凍循環下有統計學上的顯著下降。這是顯而易見的，因為一些顯著的下降早在第二次解凍時就發生了，僅下降了1%。由於有報道稱血漿膽固醇、LDL-C和HDL-C水平的日變化分別隻有6%、7%和6%[13-15]，因此濃度下降隻有1%要小於其日變化。因此，小於每日變化的測量結果，即所有操作後的脂質濃度，被認為不顯著。即使甘油三酯的濃度在第7次解凍時下降了10%，但仍低於甘油三酯的日變化(20%)，也被認為是一種非生理性的下降[13-15]。盡管有統計學上的下降，但LDL-C、HDL-C和總膽固醇濃度最高和最低的值也發生了同樣的百分比的變化。相比之下，測量到的甘油三酯濃度下降幅度最大vs最小值。

由於最近的研究表明脂蛋白-膽固醇濃度並不能真正指示脂蛋白代謝和調節失調，因此也測量了脂蛋白的大小和蛋白質組。雖然脂蛋白的大小隻是代謝的一個快照，但它是代謝改變的一個更好的指標。例如，小的高密度脂蛋白顆粒被認為最能將膽固醇排出細胞，而大的高密度脂蛋白顆粒則更容易被組織吸收。雖然從細胞中吸收膽固醇的能力一直被認為是HDL的關鍵功能，但現在人們認為HDL可以向組織輸送各種因子，因為HDL顆粒攜帶>90個蛋白質和>100種不同的脂類，其中許多具有生物活性[4,5,22 -24]。在目前的研究中，盡管高密度脂蛋白顆粒的平均大小沒有隨著凍融循環次數的增加而變化，但隨著循環次數的增加，中、大型高密度脂蛋白顆粒似乎轉變為小型高密度脂蛋白顆粒。不同大小顆粒數量的標準差沒有增加，這表明所有顆粒的粒徑都發生了類似的變化，組間的比較是相對的。因此，隻要樣品解凍的次數相等，並且注意到較小的高密度脂蛋白顆粒的數量可能有誇大的增加，就可以在儲存的血漿中分析高密度脂蛋白的大小。盡管大小不同，但冷凍/解凍對HDL所攜帶的每種蛋白質的肽計數沒有影響，包括載脂蛋白。我們還確定了冷凍和解凍對LDL和VLDL大小的影響。VLDL的大小不隨樣品的冷凍和解凍而改變。 There was a decrease in the number of large LDL and an increase in the number of IDL, however. As the internal non polar core of the particle would need to be increased by lipids for this to occur, it is possible that either some of the core triglyceride or cholesteryl ester from medium and large HDL blebs off and combines with the large LDL to form IDL or LDL particles fuse together to form IDL. Unlike HDL, the standard deviation for large LDL increases with increasing number of thaws suggesting that not all particles change the same with thawing in the cold. Thus, it appears that as long as samples have been thawed three times, sizing can be performed. More than three thaws would suggest potential misrepresentation of the number of large LDL particles. As LDL heterogeneity is the cause of various functions of different sized LDL and IDL particles [25, 26], it is important to know the number of thaws before interpreting data obtained.

細胞因子濃度也被測量，當樣品反複解凍和再冷凍時，細胞因子濃度似乎不像脂蛋白-膽固醇和甘油三酯濃度那樣恒定。此前的研究表明，凍融對細胞因子和CRP測量的影響非常小，但對細胞因子和CRP測量的影響卻非常大[27- 30]。使用更新的Multiplex方法，我們發現IL-6、IL-1β和hsCRP濃度隨著解凍次數的增加而降低，而IL-8和TNFα濃度沒有顯著變化，使用20%的每日變化率作為生理變化的分水嶺[28- 30]。重要的是，經過多次凍融循環後，濃度下降最顯著的是那些濃度顯著升高的樣品。去除測量值最大的樣品後重新計算平均值，解凍和再冷凍樣品對細胞因子濃度的影響減小。

總之，我們發現，在多次凍融循環和長期儲存的情況下，脂蛋白-膽固醇、甘油三酯和細胞因子的循環水平在統計上有顯著下降;本研究的一個局限性是長期儲存隻有18個月。對於脂類來說，盡管變化顯著，但相對較小，比每天的變化要小。在多次凍融循環中，TNF α和IL-8的降低幅度相對較小，而IL-6、IL-1β和hsCRP的測定濃度在第7次解凍時下降更為顯著。有趣的是，hsCRP和血漿細胞因子測定濃度的最大降低發生在濃度顯著升高的樣本中。反複解凍和再凍結對樣品的最大影響是HDL顆粒大小從較大顆粒向較小顆粒轉變，而HDL蛋白質組沒有改變，大的LDL向IDL轉變。由於標準偏差不隨著HDL和IDL解凍次數的增加而增加，因此樣本的變化應該都相對相似。然而，反複凍融循環的影響確實導致大LDL顆粒的標準差增加，因此在某些組中顆粒數可能被低估，因為變化在所有樣本中並不一致。因此，隻要所有的樣本都被相似地處理，並且知道樣本之前解凍的次數，重新分析以前研究中的樣本細胞因子濃度和脂蛋白組成是適當的，將有助於更快速和有效地確定新的生物標誌物

確認

這項研究的資金由比爾和梅琳達·蓋茨基金會(LAW)的第二階段大挑戰獎支持。作者感謝辛辛那提兒童醫院醫療中心的生物化學和流式細胞術研究中心的樣本分析，以及辛辛那提兒童醫院的臨床轉化研究中心(CTRC)的樣本收集和製備。CTRC的服務由臨床和轉化科學獎(CTSA)編號UL1 TR001425支持。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Rebholz SL, Melchior JT, Welge JA, Remaley AT, Davidson WS，等(2017)多重冷凍/解凍循環對與不良妊娠結局相關的潛在新型生物標誌物測量的影響。臨床檢驗醫學2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2572-9578.107

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出版的曆史:

收到日期:2017年1月05日

接受日期:2月15日2017

發表日期:2月21日2017