摘要

半乳酵母發酵濾液(GFF, Pitera™)是一種酵母提取液，用作化妝品中的保濕劑。GFF表現出抗衰老、屏障健康和推定的皮膚色素減退作用，提示治療白癜風的潛力;因此，GFF的抗氧化性能是我們研究的重點。用0-10% GFF處理包皮來源的正常人表皮黑色素細胞(NHEM)。MTT法測定細胞活力。活性氧(ROS)通過熒光顯微鏡和發光檢測。mRNA和蛋白質的表達分別通過RNA-seq轉錄組分析和Western blot分析進行定量分析。GFF在4-叔丁基酚(4TBP)挑戰的NHEM中維持細胞活力並抑製ROS生成。GFF還抑製過氧化氫(H₂O₂)在UVB (Ultraviolet-B)照射下產生。RNA-seq和Western blot分析顯示，GFF顯著改變核因子、紅係2-樣2 (Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)通路介導的II期抗氧化酶(HO1、NQO1、TXNRD1)的mRNA和蛋白水平。在NHEM中，HO1在細胞質和細胞核中都是高度誘導的(6倍和8倍)。總之，GFF通過上調內源性抗氧化酶水平，有效抑製ROS的產生通過激活Nrf2-ARE通路;因此，啟動和保護NHEM免受氧化攻擊。

關鍵字

Galactomyces發酵濾液;Nrf2-ARE;Hemeoxygenase 1 (HO1);NAD(P)H醌氧化還原酶1 (NQO1)硫氧還蛋白還原酶1 (TXNRD1)

簡介

白癜風是一種由於表皮黑素細胞的喪失或功能障礙而引起的獲得性色素減退疾病。對其病因的了解還不完全，但各種研究證實了細胞毒性、氧化應激和係統免疫失調的影響。與其他皮膚細胞類型相比，表皮黑色素細胞天生容易受到過量自由基和隨之而來的氧化應激[1-3]。由於黑色素合成涉及活性氧(ROS)和黑色素中間體的生成，黑色素細胞保持固有的促氧化作用;這種脆弱的狀態加上暴露在諸如紫外線輻射(UVR)、激素、壓力或細胞毒性化合物等加重因素下，可導致色素沉著或氧化驅動的皮膚病的進展[4-7]。因此，有效地管理色素紊亂，同時鼓勵黑素細胞活力是重要的。

轉錄因子核因子，紅係2-like 2 (Nrf2)被認為是一種通過與主要抗氧化酶啟動子中的抗氧化反應元件(ARE)結合來保護細胞和存活的中央調節因子。Nrf2-ARE通路受到細胞氧化還原狀態變化的刺激，並通過上調抗氧化、異種生物代謝和其他細胞保護蛋白和酶組成超過600個基因靶標，發揮恢複內穩態的作用[8-9]。科學文獻也逐漸揭示了Nrf2在皮膚細胞代謝和保護中的重要作用[10-13]。

大多數研究認為氧化還原失衡與白癜風的發病機製有關[14-16]。氧化還原的影響包括氧化狀態的全身性增加和抗氧化狀態的同時降低;過氧化氫酶(CAT)、穀胱甘肽過氧化物酶(GPX)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)等酶促抗氧化劑的下調;過氧化氫(H₂O₂)和過氧亞硝酸鹽(ONOO-)已被記錄在案[17-25]。各種科學研究將白癜風與氧化應激的多種經典表現聯係在一起，如脂質過氧化、信號信號受損、結構不規則和細胞細胞器功能障礙[26-31]。有趣的是，最近的研究表明在白癜風病理生理中Nrf2-ARE通路信號通路和功能元件受損[32-35]。因此，通過選擇性誘導Nrf2-ARE通路，正常化細胞氧化還原狀態，增加對過度ROS積聚的潛在保護，是預防氧化驅動疾病(如白癜風)侵襲的主要策略。

半乳菌發酵濾液，商業上稱為Pitera™，目前被用作護膚品中的化妝品成分。GFF是一種酵母提取液，含有獨特的維生素、礦物質、小肽和低聚糖成分。GFF的研究闡明了抗衰老、屏障健康和假定的皮膚低色素作用[36-40]。然而，對其特性的全麵描述仍在進行中。

在這項研究中，我們研究了GFF對正常黑素細胞的治療，以進一步了解其抗氧化能力和誘導細胞健康的益處。我們在不同時間點分析了這一結果，評估了GFF的基因組、蛋白質和生理序列後果。我們證明GFF治療通過激活黑素細胞中的Nrf2-ARE通路，中和了潛在的氧化攻擊，並上調了下遊的II期抗氧化酶。這些特性可能對黑素細胞氧化還原病變(包括白癜風)有用。

材料和方法

細胞培養

正常人表皮黑素細胞(NHEM)的原代培養是從不同皮膚類型的廢棄新生兒包皮中建立的，如前所述[41]。組織是從辛辛那提大學醫院或辛辛那提基督醫院采購的。由於美國法律關於手術遺留的人體組織，實驗不需要患者的同意。簡單地說，用碘碘和磷酸緩衝鹽水(PBS)清洗包皮，切片，在0.25%胰蛋白酶中孵育，然後在4℃搖動過夜。組織被旋渦和離心分離表皮和真皮。表皮部分鍍於含有黑素細胞生長培養基的T25或T75燒瓶中。黑素細胞生長培養基為MCDB-153 (Sigma-Aldrich)，添加4%胎牛血清(FBS)、1%抗生素/抗真菌藥、15 μg/mL牛垂體提取物(BPE)、5 μg/mL胰島素、8 nM 12- o -十四烷酰-磷-13-醋酸酯(TPA)和0.6 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，以促進細胞增殖、樹突狀和黑素化。培養物保存在5% CO的潮濕培養箱中₂在37°C。每3 ~ 4天更換一次培養基。在實驗中，通過肉眼檢查形態和色素沉著來評估中度著色的NHEM的純度，並從3-5篇文章中選擇和使用。隨後的質量控製評估通過Western blot分析黑素原蛋白表達、酪氨酸酶(TYR)和/或酪氨酸酶相關蛋白1 (TYRP1)，以及免疫細胞化學檢測角蛋白表達。

人造石鋪地麵處理

GFF使用兩種不同的專有過濾方法製備:常規方法gf - a和增強方法gf - b。濾液在神戶技術中心寶潔創新Godo Kaisha製備;用幹冰運到實驗室;4℃保存。實驗開始前，將NHEM培養物鍍膜，在添加6%胎牛血清、1%抗生素/抗真菌藥、15 μg/mL BPE、5 μg/mL胰島素、2 nM TPA和0.15 ng/mL bFGF的MCDB-153實驗培養基中孵育48小時。試驗期間，在試驗培養基中每48 h添加0-10%的gf - a或gf - b處理NHEM，持續5-7天。在單日試驗中，NHEM在實驗培養基中添加0-10%的gf - a或gf - b，然後在指定的時間點收獲。所有培養物均保存在5% CO的濕潤培養箱中₂37°C，直至實驗收獲。

4真沸點管理

4-叔丁基酚(4TBP)如前麵所述[42]被注入NHEM。簡而言之，將4TBP (Sigma-Aldrich)溶解在70%乙醇中，以指定的最終濃度(0 ~ 300 μM)添加到實驗生長培養基中。對照組用70%乙醇(最高0.5%乙醇終濃度)處理。

紫外線照射

白種人/淺色素NHEM在PBS中孵育，並用UVB 90或105 mJ/cm照射²使用FS20燈，峰值發射在313 nm，如前所述[43]。照射後，細胞與0-10%的GFF-B在實驗生長培養基中培養，直至指示收獲。

MTT細胞活力測定法

200 μM 4TBP和0-10% gf - b單獨或聯合處理NHEM 6 d。在收獲後，根據製造商的說明，用MTT測定(生物測定係統)測定細胞活力。簡而言之，1 × 10⁴細胞/孔在6孔板中重複接種三次過夜。在細胞中加入MTT試劑(四唑)，37°C加濕室培養4小時。四唑在活細胞的線粒體中被轉化為福馬讚。在增溶緩衝液中溶解形成的福馬甲晶體，並在微板讀取器(Bio-Rad, 550)中讀取波長。固定作為陰性對照。細胞活力由吸光度讀數計算，結果以對照的百分比表示，n=3。

熒光ROS可視化

NHEM分別用300 μM 4TBP單獨或與10% ff - b或30 U過氧化氫酶(Sigma-Aldrich)聯合作用90分鍾。根據先前描述的[42]，使用Image-IT®LIVE綠色活性氧檢測試劑盒(分子探針)對ROS生成進行可視化。在奧林巴斯IMT-2倒置顯微鏡(20倍)上捕獲相位對比和熒光顯微鏡圖像。為了量化ROS，每組多張圖像尺寸標準化，使用圖像J測量平均強度(減去背景)，產生校正的總麵積熒光(CTAF)， n=30。

H₂O₂一代光度計測定

白種人/淺色素NHEM在PBS中加入或不加入10% GFF-B，然後立即用上文提到的UVB (105 mJ/cm2)照射。在不同的時間點(0、15、30和45分鍾)收集樣本，然後分析H₂O₂通過發光產生如前麵描述的[44]。簡而言之，PBS等分液被轉移到帶有呼吸緩衝液和魯米諾(Sigma-Aldrich)的管中。H₂O₂釋放度通過光度計(Turner, TD10e)測量的發光來確定。根據已知H2 - O2濃度的標準曲線繪製讀數。結果用pMol H表示₂O₂/ 1 × 10⁵細胞,n = 3。

RNA-seq轉錄組分析

基於Illumina hiseq的下一代測序RNA-seq分析采購自辛辛那提大學醫學院環境衛生係基因組學、表觀基因組學和測序核心(GESC)。beplay最新下载用10%的gf - b處理具有功能性MC1R(由Zalfa Abdel-Malek博士實驗室進行循環AMP分析測定)的白種人/淺著色NHEM細胞係。大樣品(鍍4 × 10⁶在兩個時間點:24小時和120小時(5天)收集細胞，以評估相對早期和晚期基因表達。用冷PBS乙二胺四乙酸(EDTA)溶液刮取細胞並從培養皿中分離，離心，在RNAlater®(Thermo Scientific)溶液中培養。簡而言之，來自樣本的mRNA被擴增並轉化為帶有適配器的cDNA片段庫。對每個分子進行測序，生成短序列Reads (SSRs)，並將SSRs與參考基因組對齊。繪製了基因組尺度的轉錄圖譜，每個基因外顯子的總reads決定了該基因的可量化表達水平。從生成的報告中，僅考慮與對照相比，gf - b上調或下調≥2倍且伴隨p值<0.05(概率方程[45])的處理對基因有顯著影響的基因進行進一步研究，n=1。

蛋白質的測定

用含有蛋白酶和磷酸酶抑製劑的放射免疫沉澱試驗(RIPA)緩衝液從細胞中提取蛋白質。細胞在4°C下以10,000 RPM離心10分鍾。將蛋白上清/裂解液從細胞顆粒中分離出來，放在冰上。用Pierce法製備2 ~ 10 μL等分物^®BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo Scientific)。在570 nm的吸光度下，用牛血清白蛋白(BSA)標準物在microplate reader (Bio-Rad, 550)中分光光度法讀取比色測定。蛋白含量結果根據BSA標準曲線計算，以蛋白μg計，n=3。

免疫印跡分析

在如上所述的ripa -緩衝液中孵育後，提取並分離整個蛋白質裂解物。用NE-PER™進行細胞質和核蛋白提取。核和細胞質提取試劑試劑盒(Thermo Scientific)根據製造商的說明。在收獲、裂解液提取和蛋白質測定之後，等量的庫存等份在-80°C冷凍，直到Western blot處理。用細胞蛋白裂解液進行Western blot分析，方法與前麵描述的[41]類似。將40-80 μg蛋白等分裝於10%或12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)或8-12%的預製中梯度凝膠(Novex, Invitrogen)上電泳，轉移到硝化纖維素膜上。用含有1% Tween 20 (TBST)的tris緩衝鹽水中的5%牛奶或BSA阻塞膜。初抗包括:HO1、NQO1、TXNRD1和Nrf2 (Santa Cruz)。應用適當的辣根過氧化物介導的抗兔或抗小鼠免疫球蛋白G二抗(EMD Millipore)。Actin HRP和Lamin A/C作為加載控製(Santa Cruz)。 Bands were detected by chemiluminescence with Molecular Imager VersaDoc (Bio-Rad, MP 5000) and then quantified by densitometry using ImageLab (Bio-Rad). Results are expressed as a percentage of the control. Numerical data is generated from small samples (plated at 1 × 10⁶細胞)從三到四個不同的細胞係，三副本或四副本的小樣本從一個單細胞係，或大樣本(鍍3 × 10⁶細胞)從一個細胞係，n=1-4。

統計分析

數據統計分析采用單因素方差分析，其次是f檢驗和Student 's t檢驗。p<0.05為顯著值。標準偏差(SD)在指定的地方報告。

結果

GFF保護細胞活性，抵抗誘導的細胞毒性

第一個實驗計劃是確定GFF對細胞活力的拯救潛力。我們用4TBP(一種對黑素細胞有細胞毒性的酚醛脫色化合物)挑戰NHEM，單獨或與0-10%的gf - b聯合使用6天。用MTT法分析細胞活力(圖1)。與乙醇對照相比，單獨使用4TBP是唯一在活力上有統計學降低的治療組。單獨使用5%的gf - b不會顯著改變細胞活力，而所有濃度的gf - b(2.5%、5%和10%)都挽救了4TBP聯合治療組的細胞活力。這一結果顯示了對誘導的4TBP細胞毒性的保護作用。

圖1:GFF對4TBP細胞活力的影響挑戰了NHEM。
NHEM分別與200 μM 4TBP單獨或與2.5-10%的gf - b聯合處理6 d。MTT法測定細胞活力。與乙醇對照相比，僅4TBP顯著降低了細胞活力;因此，在所有濃度下與gf - b共處理均表現出對NHEM的保護作用。固定作為陰性對照。結果以控製的百分比表示。* p < 0.05, SD, n = 3。

GFF抑製ROS的生成

接下來，我們在細胞培養模型中評估了GFF的抗氧化作用，使用顯微鏡觀察ROS的熒光分析法(圖2A)。我們將300 μM 4TBP單獨或與10% GFF-B結合使用90分鍾，對NHEM進行挑戰。過氧化氫酶是一種已知的抗氧化劑，可以清除H₂O₂，作為陽性對照。正如預期的那樣，4TBP單獨增加了活性氧產生對應的熒光信號，並且在統計學上高於所有其他治療組。4TBP和10% ff - b共處理可降低熒光信號，抑製ROS誘導。這一結果與10% gf - b單獨處理和4TBP和過氧化氫酶共處理中識別的減弱信號相同。

圖2:GFF對4TBP和UVB誘導ROS生成的影響。
(一)NHEM分別用300 μM 4TBP或10% gf - b聯合作用90分鍾。用熒光顯微鏡觀察活性氧，用圖像j測定校正總麵積熒光(CTAF)， GFF-B聯合處理顯著抑製暴露於4TBP的NHEM產生活性氧，其效果與過氧化氫酶陽性對照相當。相位對比顯微鏡(上圖)和熒光顯微鏡(下圖)。*p<0.01，±SD, n=30。
(B)NHEM加入10%的ff - b，用UVB (10⁵mJ /厘米²)為H₂O₂在指定的時間點(0-45分鍾)生產直至收獲。在15-45分鍾的時間點，gf - b減少了UVB輻照NHEM中H2 - O2的生成。結果以pMol H表達₂O₂/ 1×10⁵細胞,SD, n = 3。UV 105+10% GFF-B與UV 105比較p<0.05;^p與對照組相比UV 105+10% ff - b <0.05。

然後我們進行了一個特定的H₂O₂魯米諾熒光定量分析。染色較淺的NHEM加或不加10%的ff - b孵育，用UVB 105 mJ/cm照射²．H的生成₂O₂然後隨著時間的推移(0、15、30和45分鍾)，通過測定細胞保存時PBS的等分(圖2B)進行監測。在15min時間點，10% gf - b顯著抑製uvb誘導的H₂O₂與未處理和輻照的對照組相比降低了70%。H的抑製₂O₂繼續實驗的其餘部分。總的來說，這些結果表明GFF處理能夠抑製NHEM中的ROS，從而確保快速和持續的抗氧化作用。

GFF激活黑素細胞抗氧化反應

為了了解GFF處理在人類黑素細胞中誘導的全局基因表達變化，我們獲得了基於Illumina hiseq的下一代測序RNA-seq分析。從生成的報告中，我們選擇了在兩個時間點(24小時和120小時)受到10% gf - b處理顯著影響的基因，其上調或下調水平是未處理對照細胞的2倍以上，用於進一步研究。RNA-seq分析顯示，GFF處理24小時後，共有3574個基因發生≥2倍的突變，其中533個基因的p值<0.05。第二個時間點，120小時，顯示3466個基因被改變≥2倍，其中572個基因由於GFF處理p值<0.05(圖S1)。我們的分析集中在與氧化應激和內源性抗氧化反應相關的基因類別，最初關注的是24小時時間點。與適應性氧化應激反應相關的幾個基因靶點被調節≥2倍(圖3)。絲裂原激活蛋白激酶10 (MAPK10/JNK3)上調，而其潛在下遊信號靶點Jun B原癌基因(Jun B/AP-1)下調，表明響應性應激通路可能被轉錄激活。此外，來自Nrf2-ARE通路的三種抗氧化酶包括血紅素加氧酶1 (HMOX1/HO1)、NAD(P)H醌氧化還原酶1 (NQO1)和硫氧還蛋白還原酶1 (TXNRD1)均顯著上調(表S1)。然而，穀胱甘肽過氧化物酶3 (GPX3)和超氧化物歧化酶3 (SOD3)，這些酶可以中和H₂O₂超氧陰離子(O₂-)，均被下調。細胞色素B-245， α多肽(CYBA)，一種參與O₂-產生和吞噬，也被觀察到;這意味著ROS合成抑製的保護性輸出。這種抗氧化反應部分維持在第二個時間點120小時(5天)(表S2)。總之，這些數據表明GFF能夠成功激活NHEM中抗氧化和保護基因的轉錄。

圖3:GFF對NHEM中各種氧化應激靶點的影響[由Morel & Barouki, 1999修正]。
RNA-seq轉錄組譜分析采用NHEM中提取的mRNA，經10% GFF-B處理24小時和120小時(5天)。在24小時時間點，gf - b處理調節了幾個與氧化應激相關的基因靶點，其折疊變化≥2,n=1;包括MAPK10=絲裂原活化蛋白激酶10;JUNB =原癌基因;CYBA=細胞色素B-245， α多肽;HMOX1 =血紅素加氧酶1;TXNRD1 =硫氧還蛋白還原酶1;GPX3 =穀胱甘肽過氧化物酶3;NQO1 =NAD(P)H醌氧化還原酶1;SOD3=細胞外超氧化物歧化酶3。 Green indicates downregulation, red indicates upregulation, and no color indicates fold change <2.

GFF上調了Nrf2-ARE下遊靶點HO1、NQO1和TXNRD1

為了驗證RNA-seq數據，我們進行了Western blot分析，以闡明抗氧化靶點的蛋白表達。NHEM培養在長期和短期實驗方案中進行評估。在長期方案中，NHEM分別用或不用10%濃度的gf - a或gf - b處理5-7天。給藥完成後，提取全細胞蛋白裂解物並進行分析(圖4A)。用gf - a和gf - b處理的NHEM顯示Nrf2多素化蛋白和II期酶HO1、NQO1和TXNRD1蛋白表達顯著增加。在所有實驗中，上調相對2倍。

圖4:GFF對Nrf2-ARE通路的影響。
(一)NHEM分別加或不加10% gf - a和10% gf - b處理5天或7天。收獲時，用Western blot和密度法分析蛋白表達。多泛素化的Nrf2分別增加了44%和57%。HO1和NQO1表達在10% gf - a和10% gf - b下幾乎翻倍。10% GFF-B治療後TXNRD1升高68%。結果以控製的百分比表示。*p <0.05, SD, n=3-4。
(B)NHEM給予10% gf - b單劑量8 h。蛋白裂解物的細胞質和核部分用Western blot和密度法分析，n=1。Nrf2在細胞質和細胞核中的表達量增加30%。多素化的Nrf2在細胞質中也增加了41%。HO1具有高誘導能力，胞質與細胞核之間的增殖倍數分別為6倍和8倍。TYR和lamin在適當的情況下用作提取分離對照。

短期，單劑量10%的ff - b也用於分離的細胞質和核蛋白裂解物部分的研究。最初，在4、8和24小時進行時間過程實驗，以了解蛋白質表達的趨勢並選擇最佳時間點(數據未顯示)。用10% GFF-B處理NHEM的細胞質和核蛋白部分8小時後進行評估(圖4B,S2)。在核部分進行TYR染色(沒有TYR的表達)，在細胞質部分進行lamin染色(沒有lamin的表達)，以確認細胞質和核部分充分分離。與對照相比，在處理過NHEM的GFF的核和細胞質部分都顯示出Nrf2的增加。值得注意的是，HO1蛋白在細胞質和核組分中分別增加了6倍和8倍。這一係列的實驗證實了GFF確實通過激活Nrf2-ARE途徑上調抗氧化酶的表達。盡管Nrf2在RNA-seq數據中沒有顯著影響，但在Western blot實驗中調整到更短的時間點產生了陽性結果。我們補充研究了UVB照射後NHEM中GFF對Nrf2-ARE的影響。NHEM分別用或不加10% gf - b預處理6天，UVB照射90 mJ/cm²然後再進行24小時的治療。在收獲時用Western blotting法評估NQO1和HO1的表達(圖S3)。分析顯示NQO1水平在NHEM照射後保持不變。HO1再次表現出巨大的誘導性;然而，在未經處理的、經過照射的NHEM中，表達幾乎無法維持。總之，這些數據說明了GFF通過介導Nrf2-ARE通路，在NHEM中激發內源性抗氧化能力的積極能力。

討論

在本研究中，我們證明了GFF有效地抑製了ROS的生成，並成功地在細胞毒性、脫色化合物4TBP和UVB輻射攻擊的NHEM中執行了保護能力。我們的研究數據使我們得出結論，GFF在NHEM中具有有效的抗氧化能力，這部分是通過激活Nrf2-ARE通路上調抗氧化酶HO1、NQO1和TXNRD1來實現的。Nrf2-ARE通路轉錄的確切或最早時間尚未闡明。更短時間點(0-90分鍾)的實驗結果也表明GFF可能含有非酶促抗氧化作用的生理成分。最有可能的是，包括Nrf2-ARE在內的一係列工作機製能夠產生抗氧化保護反應，這需要進一步研究。

HO1具有間接的抗氧化活性，通過催化血紅素降解為亞鐵(Fe^{2 +})有限公司H₂啊,和膽綠素。新合成的膽綠素通過膽綠素還原酶(BVR)以NADPH為代價迅速轉化為膽紅素。膽紅素是一種有效的抗氧化劑，主要清除親脂性部位的ROS，如雙分子層膜[46-49]。由於HO1的高誘導性，Fe的釋放^{2 +}是一個值得關注的問題，可能與黑素細胞中鐵蛋白水平的升高有關，而角化細胞與DNA氧化損傷增加有關[2]。生物可利用鐵是細胞毒性芬頓反應的來源;因此，需要更多的研究來闡明黑素細胞鐵和血紅素穩態的清晰圖景，特別是在紫外線照射後。在暴露於UVB的NHEM中，GFF處理無法維持HO1水平，如果遊離鐵在輻照條件下變得更具威脅，這可能是一種保護性反應;然而，UVA在誘導HO1方麵更有效[50-52]。其他作者認為與HO1匹配的高鐵蛋白水平具有保護作用[51,53]。然而，在各種模型中，HO1缺乏確實會導致氧化應激和不良病理[54-56]。

NQO1主要定位於細胞質中，作為同型二聚體存在，每個單體含有一個FAD分子。它利用NADPH通過乒乓球機製催化醌的單步2電子還原。這導致活性較低的對苯二酚物種，並可產生促進排泄的II相結合反應底物;一種有效對抗黑色素合成中產生的活性醌中間體[57]的策略。酚類化合物杜鵑花對細胞毒性的保護作用通過NQO1在B16BL6小鼠黑色素瘤和NHEM中過表達，如[58]所描述的，與我們研究中GFF誘導的對4TBP的保護相似。NQO1還能產生抗氧化形式的泛素酮和維生素E，並被認為在O₂-清除在這個模型中也很有用[57,59]。

TXNRD1在整個細胞質的硫氧還蛋白(TXN)解毒係統中起作用。這個係統是由過氧化物還蛋白(PRDX)領導的，它是一種能減少H的抗氧化酶₂O₂和烷基氫過氧化物，使用硫醇，主要是TXN，作為電子供體在其催化作用。TXNRD1利用NADPH將氧化硫氧還蛋白二硫化物(TXN- s2)再生為硫氧還蛋白(TXN-(SH)2)。該係統在多種細胞功能中起著重要作用，包括轉錄因子的氧化還原控製、脫氧核糖核酸合成和細胞生長[60]。TXNRD1還能夠再生其他抗氧化化合物，如抗壞血酸、含硒物質、硫辛酸和泛素酮;並支持α-生育酚功能[61]。

GFF誘導的ARE反應在其他模型中也有報道。如[39]所示，GFF聯合治療導致脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達下調，HO1表達同時上調。根據Finlay DR等人的描述，在分別和聯合使用GFF和橄欖油衍生物處理後，ARE通路在人角質形成細胞和成纖維細胞中發生了潛在的調節。[62]當用GFF和/或橄欖油衍生物處理時，在原代細胞培養物和人皮膚外植體培養物中，HO1表達均以劑量依賴性的方式增加。然而，該小組得出結論，基於在原代培養中觀察到的HO1上調幅度，ARE-32(一種基於熒光素的報告細胞係)中顯示的ARE轉錄遠低於預期，這導致他們懷疑低氧誘導因子1 (HIF1)參與其中，HIF1是介導HO1的另一種轉錄因子[63]。HIF1激活與HO1、NQO1和TXNRD1同時上調無關;因此，表明Nrf2- ARE參與其中。在本研究中，與橄欖油相比，GFF對HO1表達的影響也較小。有報道稱，0.1%濃度的GFF和綠茶黃酮表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)可單獨或協同抑製人角質形成細胞中ROS的生成[64]。每種化合物都不能單獨克服TNFα誘導的ROS生成; it was only effectively suppressed in combination. GFF may have a special utility in the therapy of oxidative driven dyspigmentation disorders like vitiligo. Vitiligo onset is typically instigated by increased facultative melanization that is commonly triggered by precipitating factors such as Ultraviolet Radiation (UVR), hormones, cytokines, trauma, etc. This induced melanization elevates cytotoxicity through increased melanin intermediates and ROS generation that is intolerable by the genetically predisposed vitiligo melanocyte, resulting in immune targeting and cell death [6]. GFF also has putative antimelanogenic capacity. The combined GFF antioxidant and anti-melanization properties would be useful in a prevention strategy against early onset vitiligo to potentially impede lesion progression, or as an accompaniment in depigmentation therapy. There is no cure currently available; hence, efficient prevention and remedial strategies that can halt the progression of oxidative stress in epidermal melanocytes are desirable. It is necessary that our initial investigation was completed with normal melanocytes with functional melanogenic components and metabolic processes to understand the impact of GFF in baseline conditions. Future studies of the molecular components of GFF to map specific ingredients with the effects observed in the melanocyte, particularly HO1 inducibility; and comparing our current data in normal melanocytes to GFF treatment in vitiligo melanocyte cultures will propel this objective forward.

另一個值得注意的考慮是與合成藥物的使用和製造有關的常見不利因素。科學界的一個部門正在重新致力於自然產物的藥理效益研究。自然提取和可持續來源的治療方法的生產和製造繼續上升，受到公眾的歡迎。白癜風患者也尋求涉及天然化合物和方法論的治療方法;然而，監管、有效性和效力仍麵臨巨大挑戰[65]。GFF是一種經過過濾的酵母提取液，顯示出全麵的皮膚健康效益，可能有潛力解決這些障礙。我們的研究結果對開發GFF衍生的治療藥物具有重要的積極影響，這些治療藥物可以為ROS攻擊啟動細胞環境，幫助預防氧化驅動疾病和皮膚表皮黑色素細胞的可持續性。

作者的貢獻

概念化、T.H.與R.E.B.;方法論，J.K.W.C, A.K, A.L.K和r.e.b;形式分析,J.K.W.C A.L.K, a.k. R.E.B.;調查,J.K.W.C A.L.K, a.k. R.E.B.;資源，A.L.K, t.h.和r.e.b;數據管理，J.K.W.C, a.k.和r.e.b;撰寫原稿準備，J.K.W.C.和R.E.B.;Writing-Review &編輯,J.K.W.C A.L.K, a.k. T.H。R.E.B.;可視化，J.K.W.C.和R.E.B.;監督R.E.B.; Project Administration R.E.B..; Funding Acquisition, T.H. and R.E.B.

資金

這項研究得到了寶潔公司和美國國家白癜風基金會的支持。

的利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Cooper JKW, Koshoffer A, Kadekaro AL, Hakozaki T, Boissy RE(2019)半乳黴菌發酵濾液抑製人類黑色素細胞中活性氧物種的產生並促進細胞氧化還原平衡通過Nrf2-ARE途徑。J臨床美容皮膚素3(1):dx.doi。org/10.16966/2576 - 2826.138

版權:©2019 Cooper JKW，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2018年7月11日

接受日期:2019年2月1日(

發表日期:05年2月,2019年