摘要

我們試圖驗證使用免費軟件ImageJ計算加權發光(WL)作為免疫熒光的結果測量。直接免疫熒光(DIF)中的噪聲信號與添加抗體的濃度呈反比關係。因此，這個抗原無關信號的下降占每個圖像的大部分，允許信號強度的數學建模。對10例大皰性類天皰瘡(BP)患者和6例尋常型天皰瘡(PV)患者標本進行DIF。DIF是用標記抗體IgG和C3在稀釋範圍為1:100到1:800製備的。使用ImageJ對圖像進行處理，每次稀釋後生成綠色發光直方圖。為了確定平均WL隨抗體稀釋度增加的關係，我們生成了抗igg和抗c3抗體的對數回歸曲線直方圖。為了解釋抗原依賴性信號(即DIF圖像的免疫反應部分)的作用，我們執行了一個額外的回歸曲線，稀釋範圍限製在1:100到1:400之間，以減少Fc受體或C3不飽和的風險。BP IgG和C3稀釋的對數回歸顯示出顯著的中度到強相關性(R²=0.51, P<0.001)和(R²=0.50, P<0.001)，相關性略有下降，但經抗原依賴性信號校正後仍有統計學意義。在PV中可以看到較弱的關係，但這在統計學上也是顯著的，無論校正與否。在實驗環境中，WL對熒光信號的定量比較具有潛在的價值。使用ImageJ進行比較免疫熒光的進一步使用，如比較抗體結合或抗原表達，需要驗證WL，這是我們在此演示的。

關鍵字

定量免疫熒光;比較免疫熒光;免疫學方法

簡介

使用開源圖像軟件的定量免疫組化(IHC)可以對蛋白表達進行數字比較[1-6]。這有助於蛋白質表達的實驗比較以及某些腫瘤受體狀態的臨床分類。雖然在免疫組織化學中使用發光作為一種結果測量已經得到驗證，[6]，但它在免疫熒光中的應用還有待令人信服的證明。

在免疫熒光中使用圖像軟件分析比在定量免疫組化中使用有幾個理論上的優勢。假設使用綠色發色團，不需要額外的顏色過濾來分離所需的發色團。加權發光的使用考慮了蛋白質密度。由於顏色閾值的選擇顯示了用戶間的顯著差異，這是可取的[7]。此外，靶抗原的細胞位置可能會混淆IHC[8]中發色團的分離，在免疫熒光中不需要考慮這一點。

由於隻需要評估單一的原色，可以生成一個聚焦的直方圖進行分析。為了考慮到更強烈的顏色代表異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗體濃度的增加，加權發光可以用作結果測量。黑色像素(沒有發色團的像素)的權重為零，而完全飽和發色團的像素的權重最高。

比較免疫熒光有幾種應用，包括比較不同抗體與固定組織的結合，或使用固定抗體或探針(如熒光)比較不同組織源的抗原表達原位雜交(9 - 12)。為了在這些應用中使用ImageJ，我們試圖評估加權發光(WL)作為量化免疫熒光信號的結果測量的有效性。在DIF中使用以對數增加的fitc標記抗體濃度，使我們有機會對總體信號強度的對數下降進行數學建模，因為占信號大部分的信號噪聲率與標記抗體的濃度成反比，而不依賴於目標抗原的濃度。DIF的抗原依賴部分(即免疫反應部分)是除稀釋濃度的fitc標記抗體外的少數總信號。雖然在DIF中測量熒光信號本身沒有臨床意義，但當每個標本中的組織和一抗保持不變，而隻有二抗被稀釋時，它允許一種受控的方式驗證發光計算。因此，我們分析了大皰性類天皰瘡和尋常型天皰瘡患者的DIF的整體加權發光。雖然由於組織抗原的飽和，DIF信號的量化本身並不是一種臨床有用的測量方法，但使用定量免疫熒光已經在幾個應用中進行了評估，以量化和比較不同組織[13]之間的抗原表達量。因此，該實驗為使用WL作為定量免疫熒光的測量提供了驗證，可用於不同的實驗應用。

方法

DIF是對先前診斷為大皰性類天皰瘡(n=10)和尋常型天皰瘡(n=6)的患者的病灶周圍皮膚活檢的組織病理學切片進行的。DIF方法以前已經詳細描述過了[14]。簡單地說，每個樣本的組織切片與fitc標記的靶向IgG抗體(BioRad, Hamburg, Germany)和C3抗體(Biologo, Kiel, Germany)稀釋孵育。每張幻燈片立即使用BIOREVO (Keyence, neui - isenburg, Germany)係統成像。設置始終保持不變。在40倍倍數下拍攝3張顯微照片，每次稀釋的全像素數為1360 × 1024。

隨後使用ImageJ(1.48版本，美國馬裏蘭州貝塞斯達國立衛生研究院)處理圖像。將每張圖像插入ImageJ軟件，生成綠色光譜的直方圖。每張圖像的數據導出到SPSS 20軟件中。從每個直方圖中提取的數據點表示綠色發光光譜上從0(黑色)到255(飽和綠色)的像素數。我們進行了數據轉換來計算加權發光。這是由從0到255的每種顏色的總和計算出來的n / 255乘以每一種顏色的像素數。因此，黑色像素將被過濾掉，最亮的發光級別將被賦予最高的權重。

為了確定每個標本稀釋度增加時平均加權發光的關係，我們生成了大皰性類天皰瘡和尋常型天皰瘡患者的加權發光與抗igg和抗c3稀釋度的對數回歸曲線直方圖。由於信號噪聲不依賴於抗原的存在，而是DIF的免疫反應部分依賴於抗原，因此進行了兩個獨立的對數回歸分析。在不考慮Fc受體丟失或C3飽和的情況下，將加權發光與抗igg和抗C3稀釋範圍從1:100到1:800的對數回歸曲線進行比較。在抗igg和抗C3稀釋範圍為1:100到1:400的情況下進行了額外的對數回歸，從而增加了C3的Fc受體保持飽和的機會。采用方差分析(ANOVA)對同一患者在不同fitc滴度下的多個圖像進行WL同質性確認。P>0.05被認為是對同質性的確認。

結果

BP和PV中抗IgG和C3的代表性圖像分別如圖1和圖2所示。對數回歸評估了抗igg和抗c3稀釋的加權發光之間的關係，顯示出顯著的和中等到強的相關性²=0.51, P<0.001)和(R²= 0.50, P < 0.001)。對抗原依賴性免疫熒光的校正(僅在1:400而不是1:800稀釋時測量)導致加權發光與抗igg和抗c3之間對數關係的強度下降，但這種關係仍然具有統計學意義。與大皰性類天皰瘡相比，尋常型天皰瘡的回歸曲線顯示加權免疫熒光與抗igg和抗c3稀釋的相關性較弱，但仍具有統計學意義。與大皰性類天皰瘡相似，當考慮到抗原依賴性免疫熒光時，加權發光與抗igg和抗c3之間的關係強度減弱。表1給出了這些結果。不依賴抗原計算的對數回歸曲線(稀釋範圍從1:100到1:800)如圖3所示。同一患者多個標本比較的方差分析均無統計學意義(P>0.05)，提示同質性。

	稀釋1:10 - 1:800				抗原依賴性信號的校正 1:100-1:400
大皰的類天皰瘡	稀釋	王	R2	P	大皰的類天皰瘡	R2	P
免疫球蛋白	1:100	1029	0.51	< 0.001	免疫球蛋白	0.41	< 0.001
	1:200	522
	1:400	337
	1:800	117
C3	1:100	572	0.50	< 0.001	C3	0.24	< 0.001
	1:200	496
	1:400	299
	1:800	One hundred.
尋常天皰瘡			R2	P	尋常天皰瘡	R2	P
免疫球蛋白	1:100	1235	0.43	< 0.001	免疫球蛋白	0.20	0.043
	1:200	1030
	1:400	667
	1:800	284
C3	1:100	699	0.32	< 0.001	C3	０．２５	0.005
	1:200	358
	1:400	274
	1:800	161

表1:在大皰性類天皰瘡和尋常型天皰瘡患者直接免疫熒光研究中，加權發光與添加抗igg和抗c3抗體稀釋關係的對數回歸係數和P值提供了考慮抗原依賴性信號轉導的修正分析。(WL)加權發光

圖1:在大皰性類天皰瘡中直接免疫熒光，靶向A)效價為1:200的IgG和B)效價為1:200的c3

圖2:尋常型天皰瘡的直接免疫熒光作用靶標為A)效價為1:200的IgG和B)效價為1:200的c3

圖3:對大皰性類天皰瘡(a,b)和尋常型天皰瘡(c,d)患者的直接免疫熒光樣本進行加權發光*和對數回歸線，橫軸進行對數變換。
＊加權發光定義為Σ[像素計數x (n/255)]，其中n是在0到255範圍內的綠色值．

討論

使用ImageJ軟件計算的加權發光可以作為從受控照片中量化免疫熒光信號的一種有用的手段，而不需要昂貴的圖像分析軟件或用戶設置的閾值，這可能會影響觀察者之間的可靠性。它的準確性需要使用標準化的攝像機設置和抗體製劑。因此，如果設置和抗體製備始終相同，則可以進行比較。與間接免疫熒光相比，使用DIF建立對數回歸模型有一些優點和缺點。由於信號噪聲的存在，大多數信號是抗原無關的，因此可以預見的是，對數級稀釋的增加會導致信號噪聲的對數級下降。這是以包含抗原依賴性的圖像免疫反應區為代價的。與大皰性類天皰瘡相比，天皰瘡中稱重發光和抗體稀釋之間的關係強度減弱，這是最好的證明。由於IgG在尋常型天皰瘡細胞間沉積，其抗原依賴性信號相對於BP較多，BP僅局限於基底膜區。因此，隨著稀釋程度的增加，加權發光的對數下降的假設將依賴於目標抗原(Fc受體或C3)的飽和度，這並不一定會以可預測的方式下降，就像抗原無關的信號噪聲一樣。間接免疫熒光的使用將限製這一分析，因為隻有在Fc受體在一定的血清稀釋下失去飽和後，信號才會開始對數下降。 Thus, while DIF does not allow a pure analysis of antigenindependent signal changes at various dilutions of anti-IgG and anti-C3 antibodies, it provides an estimate. While further confirmatory analysis could be performed to the non immunoreactive areas of the DIF, this was avoided to prevent any changes in settings or selected areas which often plague the use of digital imaging software [7]. Thus, the performed study provides a conservative estimate of the relationship between weighted luminescence and the logarithmic drop in signal intensity.

不幸的是，DIF不能用來預測抗體滴度，因為它與患者皮膚中抗原的數量以及抗橋粒體IgG的數量有關。然而，通過證明ImageJ可以在受控環境下可靠地測量熒光信號(本研究中相同標本的連續稀釋)，該技術可以應用到熒光信號具有臨床應用價值的其他應用中

在免疫熒光分析中使用成像軟件提供了幾個有前途的特點。免疫熒光圖像的即時拍攝可以進行長期編目，從而減少因條件和光線變化而導致的反應性喪失的風險，這些變化可能會影響弱信號[15]的發光。同樣，如果控製所有其他設置和實驗室條件，可以使用加權發光作為統計比較的值進行定量和比較免疫熒光，為不同的實驗設置提供了一種免費的進行定量免疫熒光的方法。

確認

作者要感謝博士。Susanne Lemcke和Enno Schmidt對直接免疫熒光照片的慷慨貢獻。

的利益衝突

作者沒有潛在的利益衝突需要披露。這項研究沒有獲得資助。

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條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Amber KT, Zikry J(2016)驗證ImageJ在免疫熒光定量分析中的應用。J臨床美容皮膚素1(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-2826.103

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出版的曆史:

收到日期:2016年8月31日

接受日期:2016年10月21日

發表日期:2016年10月26日