摘要

背景:這篇研究論文分析了如何用病毒治療癌症。從20世紀60年代開始，人們就知道病毒可以用來對抗癌症。

方法:為了回答這個問題，我們分析了當遺傳密碼損壞時突變的受體，然後我們分析了同一家族的兩種病毒的標準VP1蛋白。之後，我們將這兩個元素結合起來。然後我們研究了REP基因及其對病毒進入和複製的影響。最後，我們研究了rAAV的合成方案。

結果:我們的結果表明，該方案是適用的，我們將獲得一種專門設計的病毒來殺死癌細胞。這種病毒將有一個完全運行的DNA，它將包含VP1/2/3基因組代碼、REP基因和ITR區域。

結論:本研究隻是理論上的，所有的步驟和方法都有很強的理論基礎。實驗還沒有進行。我們沒有測試它們的材料，但我們試圖考慮所有的影響因素。我們的研究表明，用病毒來治療癌症是可能的。

關鍵字

癌症;VP1蛋白;代表的基因;rAAV

縮寫

SOC:超級最佳肉湯;磅:Luria湯;µg/ml:微克/毫升;37°C: 37攝氏度;大腸杆菌:大腸杆菌;分鍾:分鍾;證監會:秒;轉數:每分鍾轉數;1小時:1小時;CDS:編碼DNA序列;聚t型尾:聚胸腺嘧啶尾;PCR:聚合酶鏈反應;診斷:在體外轉錄;eGFP:綠色熒光蛋白;T:胸苷;國家結核控製規劃/帽:三磷酸核苷/帽;DPBS: Dulbecco 's磷酸鹽緩衝鹽水;傳染性胰腺壞死病毒;無edta:無乙二胺四乙酸;三:Trisaminomethane;IPNV RDRP:傳染性胰腺壞死RNA依賴性RNA聚合酶ATP:三磷酸腺苷; GTP: Guanosine-5’-Triphosphate; CTP: Cytidine Triphosphate; UTP: Uridine-5’-Triphosphate; PMOL: Picomole; PPV: Porcine Parvovirus; PPV-VP2 FD: Porcine Parvovirus VP2 protein; SF9: Spodoptera Frugiperda 9; IMAC: Immobilized Metal Affinity Chromatography; Anti-PPV: Anti Porcine Parvovirus; MMTV-LTR: Mouse Mammary Tumor Virus Long Terminal Repeat; P-globin: Platypus β-globin; SDS: Sodium Dodecyl Sulfate; RCA: Rolling Circle Replication; PABS: Polyclonal Antibodies; PLC7: Phosphoinositide Phospholipase C 7; PLC5: Phosphoinositide Phospholipase C 5; PLC8: Phosphoinositide Phospholipase C 8; E1: Unimolecular Elimination; CMV: Human Cytomegalovirus; E3: Ubiquitin Ligase; pCA35: Principal Component Analysis 35; ORF: Open Reading Frame; CsCl: Cesium Chloride

重要性

這項研究非常重要。它可以將癌症從地球上根除。這是腫瘤發生的重要一步，它可以為發表它的雜誌帶來很大的名氣。

簡介

時至今日，由於眾多的環境和遺傳因素，新癌症病例的數量不斷增加，需要一種新的治療方法。

溶瘤病毒的適宜性在60年代已被認識到，第一個載體已在2000年初使用。問題是，這些病毒隻對特定器官中的特定組織有用。這種新的理論療法很重要，因為它可以用腺病毒治療27種不同的癌症。

雖然20世紀中期的研究很有價值，但是合成病毒的技術還沒有發展起來，這就導致了天然溶瘤病毒的研究。這種做法並沒有取得成功。

我們進行這項研究的目的是找到一種特定的蛋白質，當基因突變發生時，這種蛋白質會發生突變。這種接觸蛋白是非典型趨化因子受體3。通過使用這種突變的受體，病毒隻能進入癌細胞。最積極的一點是，27種不同的組織都有這種受體。這些器官有:

1.甲狀腺

2.肺部

3.唾腺的

4.食道

5.胃

6.十二指腸

7.小腸

8.結腸

9.直腸

10.肝髒

11.膽囊

12.胰腺

13.腎髒

14.膀胱

15.睾丸

16.附睾的

17.輸卵管

18.子宮內膜

19.乳房

20.壁爐

21.的骨骼

22.的脂肪組織

23.軟組織

24.皮膚

25.附錄

26.淋巴結

27.的扁桃體

方法部分

NCBI的研究證明了一種新的蛋白質表達方式是可能的。我用了他們的蛋白質表達方法。這種方法包括十個步驟。

擴增含有編碼DNA序列(CDS)的質粒(編碼DNA序列)

我們將SOC(超級最佳肉湯)培養基預熱至室溫，將含有100µg/ ml氨苄西林的LB (Luria肉湯)瓊脂板預熱至37℃，然後將水浴平衡至42℃(圖1)。

圖1:信使rna的代碼。

我們解凍了一小瓶化學成分大腸杆菌在冰上。

之後，我們添加1-5 μ l含CDS的質粒(10 pg至100 ng)到化學成分的小瓶中大腸杆菌輕輕地攪拌。加入質粒後，輕輕敲擊試管進行混合。之後，我們在冰上孵育混合物30分鍾。然後，我們熱休克大腸杆菌在42°C的水浴中浸泡30秒，不要搖晃，然後將小瓶放在冰上2分鍾。然後，我們添加250 μ l預熱的SOC培養基到大腸杆菌在37°C的細菌培養箱中，以300轉/分水平裂解細菌1小時。之後，我們將轉化混合物中的100µl和150µl塗抹在預熱的LB瓊脂平板上，並將平板倒置，在37°c下孵育一夜。菌落可見後，我們從每個平板中接種單個菌落到15 ml的培養管中，其中含有5 ml LB培養基，100µg/ml氨苄青黴素。然後，我們在37°C和300轉的轉速下將它們孵育一夜，直到培養物處於後期log或靜止階段。然後，我們分離出含有所需CDS的質粒，用分光光度計測定質粒濃度。我們還製備了20 μ l的等分樣品，在-20°C下長時間保存。

聚合酶鏈式反應(PCR)擴增質粒插入物及添加聚t尾(聚胸腺嘧啶尾)

獲得DNA模板在體外轉錄(溶)(在體外eGFP(綠色熒光蛋白)通過PCR(聚合酶鏈式反應)進行擴增。同時，通過使用帶有T120擴展件的反向引物，將120胸苷激酶(T)的聚T尾添加到插入物中。因此，生成的mrna在IVT後獲得了一個長度固定的聚a尾。然後，我們準備PCR混合物，混合反應。之後，我們把PCR管放在熱循環器中，使用PCR循環協議運行PCR。用PCR純化試劑盒按廠家說明書對PCR反應進行清洗，用20µl無核酸酶水洗脫DNA。我們還用分光光度計測量DNA的濃度。最後，我們將DNA在-20°C冷凍較長時間或直接用於IVT。

在體外診斷和轉錄

PCR後，質粒插入物被擴增並加入一個聚t尾。然後，我們準備NTP/cap(核苷三磷酸/帽)模擬混合物如。我們還混合NTP/cap模擬混合物徹底通過旋渦和快速旋轉。在那之後，我們通過輕輕地上下移液徹底混合IVT反應混合物。然後，我們對PCR管進行短暫的離心，以收集管底部的混合物。我們還在37°C恒溫器中孵育3小時。為了去除模板DNA，我們在IVT反應混合物中加入1µl的DNase (2 U/ l)。然後混合均勻，37°c孵育15分鍾，這個過程結束後，我們用RNA純化試劑盒純化反應混合物。用40µ的無l核酸酶水從自旋柱膜中洗脫2次。

用南極磷酸酶處理純化的mRNA

將9µl的10X南極磷酸酶反應緩衝液加入到79µl的純化mRNA溶液中。隨後加入2µl的南極磷酸酶(5 U/µl)，輕輕混合樣品。反應混合物在37°C孵育30分鍾。

然後，我們用RNA純化試劑盒純化反應混合物。用50µ的無l核酸酶水從自旋柱膜中洗脫2次修飾後的mRNA。

之後，我們用分光光度計測量修飾過的mRNA的濃度。我們還檢查了在260 nm/280處的吸光度比。修飾後的mRNA被aliquote為轉染所需的一次性aliquot，並保存在-80°C。

準備轉染細胞

我們用2 × 10裝盤子⁵細胞(HEK293細胞)，在細胞培養箱中37°C孵育過夜。

對細胞進行mRNA轉染

我們將修飾過的mRNA解凍，生成脂複合物進行轉染。添加25µl(2.5µg)的修飾mRNA和2µl的陽離子脂質轉染試劑至473µl的Opti-MEM (Minimal Essential Medium) I還原血清培養基。我們根據要轉染的孔的數量擴大體積。我們還通過移液將組分輕輕混合。轉染混合物在室溫下孵育20分鍾。用500µl的DPBS(杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽水)/孔清洗細胞，然後將500µl的轉染混合物添加到12孔板的一個孔中。細胞在37°C和5% CO下孵育4小時₂．然後，我們吸出轉染混合物，並向細胞中加入1ml完整的細胞培養基。在細胞培養箱中孵育24小時。

這是得到的mRNA編碼。

CAP基因的製造

根據NCBI的研究，VP3的克隆、VP1/VP3的構建和VP2的組裝是三個步驟。

克隆VP3

合成的VP3基因是IPNV(傳染性胰腺壞死病毒)株Jasper結構多蛋白的殘基735 ~ 972，其DNA序列優化為大腸杆菌的表達，但蛋白序列不變，用KOD DNA聚合酶(前向引物，

5“-AAGTTCTGTTTCAGGGCCCGACCGCAAGCGGTATGGATGCAG-3”;反向引物,

5“-ATGGTCTAGAAAGCTTTAAACTTCACCATCATCACCGCTCG-3”)。PCR產物通過不依賴結紮的方式克隆到pOPINF表達載體中(圖2)。

圖2:VP1基因所需的DNA片段。

VP1 / VP3的建設

VP3在50µg/ml卡菌西林培養的B834細胞中表達。培養物也在37℃下生長，直到600 nm處的光密度達到0.6，此時將其冷卻到20℃，添加0.5 mM異丙基β-d-巰基半乳糖黃苷誘導蛋白表達。細胞再孵育20小時，8000 × g離心收集;8℃，20分鍾，-80℃冷凍保存後，細胞球解凍並重新懸浮在50 mM Tris(三異氨基甲烷)，500 mM NaCl, 50 mM咪唑，0.2%(卷/卷)，Tween 20, pH為7.5，添加400單位牛胰腺DNase I和1片無edta蛋白酶抑製劑雞尾酒片(1升)。細胞在30000 lb/in2的條件下裂解，細胞裂解液在35000 × g, 8°C下離心30分鍾清除。清除的裂解液應用於1 ml HisTrap Ni2+親和柱，用50 mM Tris, 500 mM NaCl和50 mM咪唑在pH值為7.5的條件下洗滌，並在50 mM Tris, 500 mM NaCl和500 mM咪唑，也在pH值為7.5的條件下洗脫。洗脫液進一步通過粒徑排除色譜純化，使用HiLoad 16/60 Superdexat 200柱平衡在20 mM Tris和200 mM NaCl (pH值為7.5)和ÄKTA Purifier 10 UPC。將含有純化VP3的片段彙集在一起，用50 μ l的鼻病毒3C蛋白酶孵育。我們從濃度為2mg / ml開始，然後在4℃下等待一夜，去除n端His6標簽，然後它們通過1ml的HisTrap Ni2+親和力。一旦純化，1mg /ml的未標記VP3與全長或在4°C下孵育1小時，以促進複合物的形成。VP1-VP3複合物也通過Ni2+親和層析純化，然後是尺寸排除層析。 Finally, the fractions containing the pure complex are pooled and concentrated in 30,000-molecular-weight-cutoff centrifugal concentrators (Figure 3).

圖3:需要VP1基因密碼。

VP1/VP3與mRNA的組裝

這些是組裝mRNA和VP1/VP3基因的步驟。

IPNV RdRP被表達和純化，並生成sΔ+CCC單鏈RNA模板(圖2)。VP1催化的複製試驗在添加ssRNA模板和核苷酸之前，用50倍摩爾量的過量VP3全長蛋白在冰上孵育10分鍾。我們還添加1 mM ATP(三磷酸腺苷)，GTP(鳥苷-5 ' -三磷酸)，和0.2 mM CTP(胞苷-三磷酸)，UTP(尿苷-5 ' -三磷酸)，並添加0.3 pmol(皮摩爾)[α32P]-UTP。37°C孵育2小時後，加入2X負載緩衝液，反應停止。

組裝VP2。這些是創建VP2的步驟。

重組質粒和重組bacmid的構建

用苯酚-氯仿萃取法從豬細小病毒20-06株的細胞培養中提取基因組DNA。以其為模板，通過聚合酶鏈式反應擴增VP2片段。PPV-VP2基因用引物PPV-VP2 FD(豬細小病毒VP2蛋白)進行擴增，其中包含tatggatccgatgagtcatcatcatcaccatcaccatagtgaaaatgtggaacaac和PPV-VP2 RV, GCGTCGACTATGAGTTAGAGTTTGTATTAG。PCR產物必須用BamHI和SalI酶切，然後克隆到pFastbac1載體對應的酶切位點上，生成重組質粒pFast PVP2。重組質粒的插入經DNA測序證實。

重組pFastPVP2給予者質粒被解析為正確後，DNA變為DH10Bac™。白色菌落含有重組bacmid，因此，它們被選擇用於分離重組bacmid DNA。在DNA分離之前，有前途的菌落被劃上條紋，以確保它們是真正的白色。Bacmid DNA (B-pFastPVP2)采用酚-氯仿萃取法提取。重組Bacmid (B-pFastPVP2)進行PCR檢測。

VP2蛋白在產夜蛾sf9細胞中的表達

重組杆狀病毒含有VP2的編碼序列，n端帶有多組氨酸標記通過使用Bac-to-Bac^TM係統。重組病毒的繁殖按照標準程序進行。為了製造重組VP2蛋白，sf9細胞在2L的Erlenmeyer瓶上以120轉/分的軌道搖床上培養，以每毫升培養基約2 × 106個細胞的濃度，生長體積為30毫升，以2-3倍的感染倍數用重組病毒汙染。在感染後72小時，細胞被收集和處理。步驟如下:收集被汙染的細胞通過在3500 × g旋出轉子4 × 750 ml下低速離心15分鍾，4℃，溶解在30 ml的冰溶緩衝液中，用20 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1.0% (v/v) Triton X-100, pH為7.4，攪拌15分鍾，溫和混合。粗細胞裂解液在4℃、23400 × g高速離心20分鍾澄清，收集上清部分，用IMAC(固定化金屬親和層析)純化可溶性重組蛋白產物。

PPV VP2蛋白的純化

細胞在感染後的不同時間被收集，在200 × g離心15分鍾，並在25 mM Na中重懸₂HCO_3.pH為8.3，濃度為2 × 107細胞/ml。裂解可以發生20分鍾，之後，使用10000 g離心15分鍾清除細胞碎片。用IMAC純化重組融合的VP2蛋白。澄清的裂解液與三毫升預平衡Ni2+流線型遮蔽凝膠孵育^TM在4°c的旋轉輪子上放置16個小時，然後放入10毫升色譜柱中。在pH為7.4的條件下，用10倍柱體積的20 mM Tris, 0.3 M NaCl, 20 mM咪唑溶液將弱結合和汙染蛋白從螯合凝膠中洗掉。重組聚組氨酸標記的蛋白產物最終在3-4倍的柱體積下從填充床中洗脫，使用20 mM Tris, 0.3 M NaCl, 500 mM咪咪唑，pH為7.4。收集一毫升的分數。

十二烷基硫酸鈉SDS -PAGE和western blotting

用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法檢測重組VP2蛋白的純度和表觀分子量。使用SDS-PAGE分離純化的蛋白質，並使用濕轉移細胞進行western blotting將其轉移到硝化纖維素膜上進行染色。在昆蟲細胞受到挑戰後的0 - 5天內獲得表達蛋白用於western blotting。用5%脫脂牛奶在TBS-T中阻隔膜，外加50mm Tris-HCl和150mm NaCl;0.05%吐溫20，在pH為7.5的室溫下保存1小時。將1:1000的豬抗ppv(抗豬細小病毒)血清引入膜中，在4°C下搖一夜。

Rep基因的製造

根據《病毒學雜誌》進行的研究，REP基因可以簡單地創建。我使用了他們的七個步驟，因為ABM進行的研究表明，REP基因在rAAV殺死癌細胞的過程中並不重要。

重組質粒dna

為了誘導AAV-2 Rep蛋白的表達，生成了一個主要基於MMTV-LTR(小鼠乳腺腫瘤病毒長末端重複序列)的表達組合。MMTV-LTR的中央HaeIII亞片段在pBluescript中被亞克隆，並帶有雞p -珠蛋白(鴨嘴獸β-珠蛋白)聚腺苷酸化信號。在構建過程中，插入一個tkneo盒，生成質粒pMTneo。包含剪接rep蛋白C端序列的rep開放分析體被插入到pMTneo中生成pMTrep。

rep4O的表達結構是pCMrep40, rep52的表達結構是pCMrep52, rep68的表達結構是pCMrep68, rep78的表達結構是pCMrep78，這些表達結構主要基於包含人類巨細胞病毒直接早期啟動子的pKEX。分開表達個人的執行代表蛋白質變異的內在轉化的幫助下從8月開始,993位置rep52和rep40蛋白質合成的質粒pCMrep78 pCMrep68,借助變異剪接提供,這是G1907A pCMrep52和pCMrep78,或刪除的方式在1907年到2227年的位置插入pCMrep68和pCMrep40定點誘變的援助。pCMrep78和pCMrep68攜帶兩個額外的突變，這對野生型rep表達質粒的發展是至關重要的，這些結構都是從野生型rep表達質粒中衍生出來的。pM1被證實在AAV DNA複製的互補和DNA擴增抑製方麵具有完全的功能。

Anti-Rep抗體

單克隆抗體294-4是通過用細菌表達和凝膠純化的Rep78蛋白免疫小鼠產生的，該蛋白n端被171個氨基酸截斷。用1:400稀釋的腹水液進行免疫印跡，其中所有四種Rep蛋白都被識別出來。

細胞培養和病毒貯存

HeLa和HeLa衍生的細胞克隆在37°C的濃度5% CO中保存₂添加5%的胎牛血清和青黴素-鏈黴素的杜爾貝科改良Eagle最低必需培養基。用木炭激活胎牛血清消耗類固醇激素，以保持MMTV-LTR的基礎表達水平盡可能低。製備了2型腺病毒株。在製備AAV-2細胞株時，我們將AAV-2和ad2感染細胞的上清經冷凍解凍後離心清除，然後在56°C的範圍內處理30分鍾，以滅活輔助腺病毒。

穩定轉染細胞係的生成

很快，在轉染的前一天，2倍106的HeLa細胞被植入到直徑為10厘米的培養皿中。pMTrep (20ug)與SspI線性化並直接轉染。轉染後的第二天，細胞以每10cm直徑的培養皿105個細胞的密度進行重複。一天後，以每毫升1200微克的G418濃度開始選擇G418。通過稀釋限製，表達rep的細胞克隆兩次。

瞬時轉染

在轉染前一天，106個細胞被置於直徑10厘米的培養皿中。細胞用改良的磷酸鈣轉染方案進行轉染。在35°C和3%的CO濃度下孵育過夜₂在美國，細胞用無血清培養基清洗兩次，然後感染Ad2。去除病毒接種物後，細胞在含有106 M地塞米鬆的生長培養基中培養。

與標記寡核苷酸雜交

為了區分野生型AAV的複製和複製陰性AAV (pTAV2-3)的複製，在pTAV2-3突變的AAV中，使用了BamHI位點周圍1045位置的兩個特定區域的寡核苷酸:1039到1058位置的野生型寡核苷酸。5 ' GTCCTCCTGGATCCACTGCT 3 '，這是一個反義核苷酸，還有pTAV2-3寡核苷酸在1040到1059的位置，5 ' GCAGTGGATCGATCCAGGAG 3 '，這是一個義核苷酸。用32P標記寡核苷酸，並在58°C的6X SSC, 1 × SSC含0.15 M NaCl + 0.015 M檸檬酸鈉- 5x Denhardt試劑-0.1 mg酵母tRNA / ml-1% SDS中雜交。過濾器在63°C的6X SSC中清洗。

利用該領域的研究，[1]我們決定創建腺病毒完全複製所需的ITR區域。它們是通過mRNA的構建和連接構建的(圖2)。

AAV的創建

在ABM進行的研究中，[1]病毒很容易被製造出來。這種方法在病毒學上取得了積極的結果。這裏使用這種方法是因為該病毒沒有任何製造規範。首先，我們在PriGrow III培養基(Cat# TM003)中添加10% FBS (Cat# TM999)和1% Pen/ strep (Cat# G255)傳播HEK293細胞。轉染前一天，我們將細胞裝入一個15厘米的培養皿中。然後，在轉染當天將12µg的輔助質粒、12µg的rep/cap質粒和10µg的轉基因質粒稀釋在2.5 ml的無血清、無抗生素的培養基中，建立3質粒共轉染。然後，將溶液混合，輕輕混合。在室溫下孵育20分鍾。第三，20分鍾後，我們向DNAfectin中加入10毫升無血清，無抗生素的培養基^TM2100-DNA複合物，我們輕輕地混合溶液。之後，我們從HEK293細胞中除去生長培養基，加入DNAfectin^TM2100-DNA複合物溶液。5-8小時後，除去轉染液，向細胞中添加完整的生長培養基。細胞在37°C的CO中培養₂培養箱再培養48小時。轉染後約48小時，用細胞刮板從15厘米厚的平板上收獲細胞。在此之後，我們在1500 × g旋轉細胞5分鍾，收集細胞顆粒，並重新懸浮在0.5 ml裂解緩衝液(10 mM Tris-HCl (pH-8.5)， 150 mM NaCl)中。然後，我們通過幹冰/乙醇浴和37°C水浴旋轉3次冷凍和解凍細胞球團。最後，將得到的粗裂解物在3000 × g的溫度下旋轉10分鍾，收集上清餾分(圖4)。

圖4:AAV的遺傳密碼。

淨化

Addgenes公司進行的研究表明，一種純化rAAV病毒的新方法是可能的。使用他們的方法是因為rAAV在淨化中不需要任何特殊步驟[2]。

細胞和病毒培養

具有複製能力的E1+ Ad，即RCA(滾動循環複製)，通過在A549細胞的單分子層上形成斑塊或引起細胞病變的能力來檢測。將穩定表達Cre重組酶293Cre1和293Cre4的293來源細胞係在添加0.4 mg/ml G418的培養基中繁殖。

AdLC8和AdLC8c輔助病毒的構建

質粒是按照標準協議構建的。AdLC8輔助病毒是通過293細胞與pLC8(一種含有柔性包裝信號的質粒)和pBHG10共轉染來拯救的。pLC8的構造步驟如下:

一個9.6 kb的AscI片段被從pBG18中移除，pBG18是一個含有Ad大部分基因組的質粒，包括Ad包裝信號和反向末端重複序列，生成pLC4。通過合並兩個單鏈寡核苷酸獲得一個具有BamHI兼容末端的合成loxP位點，將其克隆到位於腺病毒5基因組左側核苷酸188的唯一BamHI位點上的pLC4上，生成pLC5。第二個loxP網站9是插入到pLC5引入loxP益生元的BamHI網站絕壓(多克隆抗體)9日生成pLC7(磷酸肌醇磷脂酶C 7)和1.4 kb的subclonation XbaI片段,包含loxP網站和neo-bacterial-expression磁帶,成獨特的XbaI網站pLC5(磷酸肌醇磷脂酶C 5)。由此產生的質粒,pLC8(磷酸肌醇磷脂酶C 8),因此包含兩個loxP網站,相隔1452 bp，兩側是Ad包裝信號和neo盒式磁帶。AdLC8cluc輔助病毒與AdLC8相似，但在E1(單分子消除)中沒有新表達盒，含有受人巨細胞病毒(CMV)主要立即早期啟動子調控的螢火蟲熒光素酶基因，並在E3(泛素連接酶)中以填充序列插入猴病毒40多聚腺苷化信號。

輔助依賴向量的構造

pCA35(主成分分析35)，其中包含大腸杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ) ORF (open reading frame)在小鼠CMV立即早期啟動子的控製下，被SalI消化，被DNA聚合酶的Klenow片段修複，再循環，生成pCA35KS。小鼠CMV-lacZ表達盒通過XbaI或BglII消化從pCA35KS中切除，並插入XbaI或BamHI中。pABS的消化。4生成pABS。4MClacZ隨後與SalI線性化，並連接到pFG140dx3獨特的XhoI位點，生成pUMA10R。因此，pUMA10R保留了腺病毒5左端5789 bp和右端6143 bp的特異性序列。e1編碼區被插入到XbaI位點的pMX2打斷。pUMA10R中1276 kb的SwaI片段被噬菌體lambda DNA中8270 bp的swi片段所取代，生成pRP1001。

AdRP1001的“搶救”和放大

用5µg的pRP1001在37°C下轉染4小時，轉染18小時後用AdLC8多重感染5個空斑形成單位的293細胞。一旦培養基被替換，細胞被孵育，直到單分子層顯示完全的細胞病變效應。細胞被刮入培養基中，經過三輪冷凍和解凍，病毒被釋放出來。得到的500 μ l的粗病毒裂解液在60 mm的培養皿上連續傳代，其中含有293Cre4細胞。在輔助依賴載體的每一輪擴增中，293Cre4細胞與AdLC8同時感染，前兩輪擴增的感染倍數為5，後續傳代的感染倍數為1。AdRP1001的放大是監控分析原油整除病毒溶菌產物在293個細胞,每個通道lacZ-expressing病毒後通過計算lacZ-positive細胞後5-Bromo-4 - chloro-3-indolylβ-d-galactopyranoside染色如下:293個細胞感染病毒培養液500µl和孵化24小時在37°c,受感染的單層膜與§洗一次,與0.5毫升的0.2%戊二醛固定,MgCl para-formaldehyde 2%, 2毫米₂PBS-在37°C下放置5分鍾，清洗，用5mm K染色₄鐵(CN)₆， 5 mM K_3.鐵(CN)₆， 2mm MgCl₂和1 mg/ml 5-溴代4-氯代-3-吲哚-β-d-半乳糖吡苷在PBS中。板在室溫下孵育一夜，確定藍色形成單位。病毒裂解物也通過分別在293和A549單分子層上的空斑測定來監測輔助病毒和RCA。AdRP1001的大規模病毒製劑是通過用1毫升AdRP1001原液加2 × 107 pfu輔助病毒感染150毫米293Cre4細胞培養皿製備的。細胞病變作用完成後，用CsCl(氯化銫)浮力密度離心純化AdRP1001病毒粒子，通過病毒條帶收集餾分，稀釋1:1000後檢測表達熒光素酶的病毒，感染293細胞。

注入的解決方案

•保護代理

•甲醛

•苯酚

•二苯氧乙醇

•硫柳汞

•抗生素:新黴素和多粘菌素B

•全動平尾

•牛白蛋白或牛血清

•白蛋白

•明膠

•紫藤

•乳糖

•山梨糖醇

•蔗糖

•多聚山梨酯20或80

結果

體外合成修飾mRNA誘導人細胞蛋白表達

DNA的構建:為了創造DNA，有必要將質粒DNA放入大腸杆菌培養物中，並將其暴露於幾種化學和熱反應中。之後，我們得到一個完整的DNA包含CAP和Rep基因和ITR區域。

DNA的轉錄:為了被轉錄，DNA必須暴露在不同的酶和溫度的變化中。我們得到一個完整的mRNA編碼，其中包含上一節中描述的所有信息。

帽基因的製造

建設VP1 / VP3:在表達VP1和VP3後大腸杆菌，培養中的化學反應大腸杆菌誘發VP1/VP3的出現。然後，混合物與mRNA組裝。我們獲得了一個VP1/3基因組複合體，沒有ACKR3遺傳密碼。

VP1/VP3與mRNA的組裝:為了組裝，這些元素必須孵育並暴露在不同的有機元素中。我們得到了VP1/3 DNA的一個完全可操作的複合物。

VP2的組裝:為了組裝VP2複合體，有必要使用胎兒細胞。基因組DNA被包含在細胞中進行複製，並施加於細胞以創建VP2複合體。創建Bacmid是為了用於創建包含VP2序列的杆狀病毒。之後，VP2複合體被病毒提取。然後，消除含有病毒的VP2，使用VP2。我們獲得了VP2基因組編碼[3-6]。

Rep基因的製造

介紹了用於生成基於a549的rep和cap細胞係的pP5-repcap-Neo質粒的構建和穩定轉染，即G418篩選，以及初始克隆的篩選。我們進一步需要通過一係列稀釋、G418重選和96孔板、24孔板和100毫米板中的克隆擴展來亞克隆初始的陽性克隆，稱為N43。我們通過轉染的方法重新篩選AAV的產生的單個亞克隆。我們還獲得了一個REP基因編碼，它將編碼病毒在細胞中的複製。

質粒構建和轉染:我們將pSub201質粒的Xbal片段替換為包含巨細胞病毒早期啟動子、增強的綠色熒光蛋白基因和具有多a信號的猴病毒-40的DNA片段，從而生成pAAVCMVGFP結構。我們使用Effectene轉染試劑進行所有瞬時轉染實驗，遵循製造商的說明。

評估rep/cap細胞係中AAV的產生:我們通過輔助腺病毒和Ad-AAV混合載體的驚人感染來檢查rep和cap細胞係中AAV的產生。在轉染過程中，我們在載體質粒轉染的前一天，用腺病毒在適當的MOIs預先感染細胞。每個細胞AAVCMVGFP的產量在84-31個細胞上測定。

DNA雜交:我們使用Qiagen genome -tip，嚴格按照製造商的說明，準備了20/G的細胞DNA總數。我們分析了10 μ g的DNA樣品的rep和cap序列，然後用BamHI消化。我們將印跡雜交到32p標記的探針上，無論是2.7 kb的cap還是840 bp的rep探針。

rAAV的創建

為了製造AAV，必須在HEK293細胞中加入AAV的基因組(REP/CAP基因)和輔助病毒。輔助病毒為AdLC8。

淨化

病毒AdLC8被蛋白質pLC8和pBHG10拯救，pLC8是一種含有“floxed”包裝信號的質粒。AdRP1001被幾種化學反應和離心力放大和挽救。

討論

VP1/VP3複合體負責病毒進入細胞。它們含有突變的ACKR3接觸蛋白的氨基酸編碼。它們很重要，因為它們是迫使病毒隻進入癌細胞的唯一途徑。

通過“the American Society of Gene Therapy”的研究，我發現VP2在治療中並不是必不可少的。然而VP2複合體可以很容易地創建和使用，而不會產生任何後果。

DNA是治療的主要部分。該DNA用於製造VP1/VP3衣殼蛋白。當DNA被合成時，它必須被轉錄成mRNA編碼，用於蛋白質的表達。

當進行此操作時，可以將mRNA編碼與VP1/VP3複合體組裝，從而獲得適應的VP1和VP3複合體(其中包含ACKR3氨基酸編碼)[7-10]。

Rep基因負責修飾腺病毒的複製。這意味著REP基因不需要特別適應。這就是為什麼在研究中使用標準協議。

rAAV被設計用來將其DNA傳遞到癌細胞中。通過傳遞它的DNA，它將迫使癌細胞產生其他腺病毒，最後，它將通過缺乏ATP殺死主題。

這種純化是必要的，也是極其重要的，因為輔助基因對病人的健康可能是危險的。

此外，腺病毒傳遞轉基因的效率也受到傳統生物學方法的限製。然而，這種新的假設治療不需要轉基因，這就是為什麼它不受主要限製的影響。

最後，免疫反應非常小。根據ABM，腺病毒可能造成的低損害及其低致病性導致非常輕微的免疫反應。這種特性使它成為潛在癌症治療的最佳候選藥物。

結論

簡言之，由於眾多的環境和遺傳因素，新的癌症病例數量將顯著增加，需要新的治療方法。

正如研究表明的那樣，用實驗室製造的腺病毒治療癌症是可能的。這種病毒含有ITR區域關閉的REP和CAP基因。這種治療方法可以有效地治愈所有類型的癌症。然而，這需要時間和金錢。所需設備的順序，REP和CAP基因的合成是開發治療癌症的rAAV所必需的所有步驟。

腺病毒的使用將大大提高影響指定器官的癌症的治愈成功率。此外，也沒有必要使用放射治療、化療、手術、免疫治療、激素治療或幹細胞移植，這些都不能提供100%的成功率，而且可能會對患者的生活產生負麵影響。

致謝

我謹向Ben Berkhout博士表示非常感謝，感謝他在本研究工作的規劃和發展過程中提出的寶貴和建設性的建議。他如此慷慨地付出時間的意願得到了非常大的讚賞。

我也要感謝埃琳娜·塔普博士就這篇手稿的修訂提出了非常寶貴的建議。

利益聲明

本文不包含任何作者進行的任何人類參與者的研究。

我聲明我沒有任何利益衝突，我同意發表這篇手稿。

我也承認，我將在更改發生後的一個月內作出另一份聲明，說明本聲明中任何事項的更改，並在癌症治療研究計劃要求時，就本聲明中所包含的細節提供進一步的信息。

我在此聲明，在任何引起或可能引起與我作為癌症治療研究項目經理職責衝突的事項中，我沒有直接或間接的金錢或其他個人利益。

我對作品的構思、設計做出了實質性的貢獻;數據的采集、分析、解釋;創造用於工作的新軟件;起草並實質性修改工作。

資金

這項研究沒有得到資助。

參考文獻

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10. Uniprot (2021) ACKR3 -非典型趨化因子受體3-智人(人)-ACKR3基因和蛋白質。［Ref。］

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Bojescu M(2021)癌症的治療。腫瘤學雜誌6(2):dx.doi.org/10.16966/2381-3318.150

版權:©2021 Bojescu M.這是一篇基於創作共用署名許可條款發布的開放獲取文章，該許可允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:15 2021年6月,

接受日期:2021年7月26日

發表日期:2021年8月10日,