摘要

背景:治療相關骨髓增生異常綜合征/急性髓係白血病(t-MDS/AML)是癌症患者接受化療或放療的嚴重並發症。確定疾病進展背後的機製將有助於設計有針對性的治療策略。本研究的目的是探討t-MDS/AML發展的遺傳基礎。

案例:對一名t-MDS/AML患者進行了外顯子組測序分析，以研究在診斷、緩解、異體移植和複發時編碼基因的體細胞突變。

結果:本研究觀察了疾病發展過程中體細胞突變的動態變化。在第3外顯子處發現TGTG插入突變Tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2 (TET2)診斷。這種突變導致移碼，在下遊產生一個提前成熟的停止密碼子，並導致功能喪失TET2．在同種異體移植後和複發時，這種突變降低到基礎水平。

結論:結果表明TET2-突變克隆在t-MDS/AML發病中可能比在複發中發揮更重要的作用，其中新的克隆具有野生型TET2梅成了主導者。

關鍵字

外顯子組測序;體細胞突變;tmd / AML;TET2

簡介

癌症患者的化療和放療可導致治療相關的骨髓增生異常綜合征/急性髓係白血病(t-MDS/AML)的嚴重並發症，這是MDS/AML疾病的一個亞組[1,2]。目前，對這種疾病采取成功的預防措施仍然是一項挑戰。最有效的治療方案是骨髓異體移植，但成功率有限[3,4]。闡明t-MDS/AML發生發展背後的遺傳機製，有望為製定預防和治療該疾病的新策略提供依據。

遺傳因素被認為是發育的主要原因新創與t-MDS/ AML相比，MDS/AML是一個更廣泛的疾病組。研究對基因異常進行了廣泛的測試，從而確定了多個功能重要基因的突變，包括Tet2, tp53, dnmt3a, asxl1, idh1,EZH2(5、6)。采取TET2舉個例子:TET2通過將5-甲基胞嘧啶(5mC)轉化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)[5]調節DNA甲基化。突變TET2如果不能完成這種轉換，就會導致癌症，特別是影響髓係[6,7]。多項研究表明，體細胞突變TET2在de novo MDS/AML中發生率較高[8-12]。t-MDS/AML檢測的研究TET238例t-MDS/AML中4例(10.5%)[13]突變。然而，尚缺乏證據來確定新生MDS/AML中相同的遺傳缺陷是否與t-MDS/AML有關。此外，為什麼同種異體移植在治療t-MDS/AML時不如治療t-MDS/AML有效新創MDS/AML仍然未知。

在本研究中，我們使用外顯子組測序[14]分析了t-MDS/AML患者在疾病診斷階段、異體移植後69天、異體移植後90天和複發時編碼基因的體細胞突變。比較在不同疾病階段確定的突變，揭示了它們在疾病發展過程中的動態變化。突變中包括tgtg插入突變TET2這種基因以其在人體中的作用而聞名新創MDS / AML。我們觀察到其在診斷時高度存在，但在同種異體移植後和複發時減少。這表明TET2-突變克隆在疾病的發病中起重要作用，但在複發中起不了作用。

情況下

道德聲明

參與研究的受試者使用了一份問卷，涉及以下主題:研究背後的原因、目的、研究方法、風險、對患者和其他人的好處、研究的替代方案、薪酬、在任何時候都能獲得護理、信息保護、受試者權利和選擇不參與。受試者同意了每一個問題，並在參與研究的同意書上簽字。該研究由內布拉斯加大學醫學中心機構審查委員會根據協議(488-11-FB)批準。

樣品采集和DNA製備

通過以下方法收集患者樣本:t-MDS/AML診斷時的FFPE(福爾馬林固定石蠟包埋)固定骨髓細胞、移植前的外周血細胞(僅用於Sanger測序驗證)、同種異體移植後69天的骨髓樣本和同種異體移植後90天的骨髓樣本。移植前采集了患者的皮膚活檢樣本。同時采集了骨髓供者的外周血細胞樣本。用Ficoll溶液分離骨髓和外周靜脈移植後的單個核細胞，用FlexiGene DNA試劑盒(QiaGen, Coourtaboeuf, France)從單個核細胞中提取DNA。從診斷時的FFPE固定細胞和皮膚活檢中提取DNA，使用QIAamp試劑盒，遵循製造商的方案。

外顯子組測序和映射

外顯子組測序遵循標準的Illumina外顯子組程序(Illumina, San Diego, CA, USA)。該過程包括DNA片段、適配器連接和使用TruSeq外顯子組富集試劑盒v2 (Illumina)捕獲外顯子組片段。序列在Illumina HiSeq2000測序儀中使用配對端模式(2X100)收集。以下步驟用於處理外顯子組序列:(a)使用Bowtie 2軟件[15]將序列映射到人類基因組參考序列人類基因組19 (hg19);(b)將SAM文件轉換為BAM文件;(c)使用Picard刪除副本(http://picard.sourceforge.net);(d)使用GATK-RealignerTargetCreator完成局部重新對齊[16];(e)使用VarScan 2調用變體[17];(f)通過篩選公共數據庫，包括單核苷酸多態性數據庫137 (dbSNP137)、1000個基因組、外顯子組變體服務器6500 (http://evs.gs.washington)，鑒定了體細胞單核苷酸多態性(SNP)和indel變體。於edu/EVS/) > 0.01)。 The variants from the patient samples were filtered with those from skin biopsy and donor cells to identify the somatic mutations present in cancer samples only. Mutations causing nonsynonymous, splicing change, and stop gain/loss were identified. Those causing damage effects were then predicted using ANNOVAR [18], which predicts deleterious effects by at least one of the six prediction programs of Sorting Intolerant From Tolerant (SIFT) [19], PolyPhen2 [20], LRT [21], MutationTaster [22], PhyloP [23], and GERP++ [24]. Sanger sequencing was used to validate theTET2插入突變。

結果

研究中分析的患者是一名59歲患濾泡性淋巴瘤的白人男性。經氟達拉濱、米托蒽醌、地塞米鬆聯合化療，患者病情緩解。三年後複發，利妥昔單抗治療無效。三年後，他再次複發，並在利妥昔單抗治療後再次緩解。3年後，患者出現血小板減少症，對強的鬆無反應。骨髓檢查顯示，50%的骨髓存在巨核細胞增生和發育不良，20%的骨髓原細胞增多。細胞遺傳學分析顯示，在21個中期中，有46個核型係存在XY，其中17個在21個中期存在XY; 42-44個複雜核型存在add(X)(q13)、del(2)(p21)、add(4)(q31)、del(5) (q13q35)、-6、-7、add(10)(q26)、-18+1-2mar[8]/46、XY[12]。診斷為t-MDS/AML。在decitabbe治療兩個周期後，骨髓中的成髓細胞減少到2%。隨後，患者內布拉斯加大學醫學中心幹細胞移植中心在標準護理下接受了骨髓異體移植。 Further, the patient received combinational treatment of fludarabine and busulfan. Bone marrow examination at 90-days post allotransplantation showed 5% blasts. Flowcytometry with 15-CD markers showed residual myelodysplasia. Cytogenetic analysis showed normal karyotype of 46 XY. MDS-specific FISH analysis [del5q31, KMT2A (MLL; 11q23) locus rearrangement, trisomy 8, monosomy 7, deletions of 7q31, 20q12 and 20q13] showed no sign of MDS-related abnormalities. The patient died three months later, at age 69.

分別在t-MDS/AML診斷時、異體移植後69天和異體移植後90天從患者骨髓細胞中提取DNA。DNA也從患者的皮膚和同種異體移植供者的外周血細胞中提取。DNA樣本用於外顯子組測序。每個樣本都被稱為基因組變異。以小等位基因頻率(MAF)>0.01為截止點，通過dbSNP、6500個外顯子組和1000個基因組數據庫過濾去除正常多態性的變異。此外，去除與患者皮膚共享的變異，以及移植後樣本與供體樣本共享的變異。從剩下的變種中，在不同的疾病階段發現了非同義的有害單核苷酸變異(SNV)和indels:在診斷時發生6個突變，在異體移植後69天發生15個突變，在異體移植後90天發生20個突變(表1和表2)。比較了三個階段之間的突變，表明在診斷和移植後之間沒有共享突變;移植後69天至90天共有8個突變(圖1)。

圖1:比較了疾病發展過程中發現的體細胞突變、移植後69天和移植後90天複發的體細胞突變。在診斷和移植後之間沒有共享突變，移植後69天至90天之間共有8個突變。

表1:外顯子組測序和作圖結果。

表2:在t-MDS/AML病例中發現體細胞突變。

在檢測到的突變中，一個四堿基插入(TGTG)突變出現在基因的第3外顯子上TET2在診斷時確定，但在移植後不確定。的2002個氨基酸殘基TET2(RefSeq NP_001120680.1)，在990處的插入突變引起移碼，在1009處產生停止密碼子TAA，導致的功能喪失TET2(圖2)。與t-MDS/AML研究中發現的突變相比，[13]表明該突變是t-MDS/AML中的一種新突變(圖2B)。

圖2:TET2突變。A) tgtg插入突變。它位於外顯子3，導致編碼幀移位，並在下遊創建一個預先終止的TAA密碼子。B)基因突變的位置TET2在t-MDS / AML。頂部標記的4個突變由研究[20]識別，底部標記的突變由本研究識別

Sanger測序用於驗證TET2疾病發展不同階段的突變。該突變被確認為真正的體細胞突變。它在診斷時存在，移植前不存在，移植後複發時再次出現，盡管在標準外顯子組映射條件下的變異呼叫三層保護下的水平非常低(圖3)TET2突變後，比較診斷樣本、同種異體移植後69天、同種異體移植後90天，野生型GCCT與插入型TGTG在相同位置的Sanger序列信號比值。結果顯示，TGTG插入信號在診斷時達到野生型GCCT信號的35%，但在同種異體移植後69天下降到9%，90天下降到4%(表3)。同時統計外顯子組數據中野生型GCCT序列和插入TGTG序列的數量，診斷時突變序列占14%(5/35)，69天占6%(4/64)，90天占6%(3/51)。兩組定量結果表明，TET2突變序列在診斷時處於較高水平，但在複發和異體移植後下降。

圖3:動態存在TET2通過Sanger測序揭示TGTG在不同疾病階段的插入TET2TGTG插入在診斷時高度存在，移植前不存在，移植後和複發時再次出現，但在基礎水平。在患者的皮膚和供體細胞中沒有相同的突變。

表3:TET2中野型與插入信號的定量關係。

討論

精準醫療被提出是一種新的醫學模式。通過在基因組和分子水平上跟蹤每個患者的疾病過程，精準醫學為確定靶向治療的特定遺傳標記提供了希望。因此，了解疾病發展過程中的基因變化對實現這一目標非常重要。我們的研究不是在患者患病期間檢測一次突變，而是在整個疾病發展過程中分析t-MDS/AML患者的體細胞突變，以追蹤疾病發展過程中體細胞突變的命運。結果顯示了多個體細胞突變的動態變化，最好的例子是突變TET2，該基因在de novo MDS/AML中起重要作用[5-13]。

作為t-MDS/AML治療的一部分，成功的異體移植有望將患者的造血係統替換為骨髓供體的造血係統，使患者恢複正常的造血功能。然而，移植後患者的複發意味著這並沒有發生，或者是短暫發生的，患者的造血係統獲得了主導地位，並對複發負責。然而，複發時的克隆與診斷時的克隆不太可能相同，這可以從(1)診斷和複發時的突變池非常不同(圖1)和(2)更高水平的突變庫中得到證明TET2在診斷時較低，但在複發時較低(圖3和表3)，這與複發時較低的爆胎率同時發生。有可能在移植後90天進行最後一次活組織檢查時TET2-突變的克隆仍然很少見，但後來占主導地位。然而，同種異體移植後90天的細胞遺傳學和FISH數據不支持這種可能性，這些數據顯示核型正常，沒有mds特異性異常的跡象。我們的解釋是TET2-突變克隆在t-MDS/AML患者的發病中有顯著作用，但在複發中沒有作用。

結論

我們的研究結果表明，跟蹤疾病特異性基因體細胞突變的動態變化，可以更精確地監測疾病發展的遺傳基礎，有助於患者選擇個性化的治療方法。

數據沉積和存取

外顯子組數據保存在歐洲核苷酸檔案(ENA)，登錄ID: PRJEB18718

利益衝突

作者聲明在這項研究中沒有競爭利益。

作者的貢獻

PC進行實驗，YK進行生物信息學數據分析，MA識別並提供患者資料，MA、SMW構思研究，SMW設計研究，並撰寫手稿。

致謝

這項研究得到了內布拉斯加大學醫學中心(MA)弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心的資助，以及內布拉斯加大學醫學中心(SMW)弗雷德和帕梅拉·巴菲特癌症中心的試點資助。

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條信息

文章類型:病例報告

引用:陳萍，Kim YC, Akhtari M，王明敏(2017)精準醫療在癌症治療中的應用實例:治療相關骨髓增生異常綜合征/急性髓係白血病患者TET2突變的動態變化。國際癌症研究分子力學3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.134

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出版的曆史:

收到日期:2017年5月22日

接受日期:6月26日

發表日期:6月30日