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文章類型:研究文章

引用:Leuschner C, Coulter A, Keener J, Alila H(2017)靶向溶瘤肽治療卵巢癌。國際腫瘤學雜誌3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.132

版權:©2017 Leuschner C，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2017年3月06

接受日期:2017年3月28日

發表日期:2017年04月04

摘要

目的:EP-100是一種新型的LHRH受體靶向溶細胞肽偶聯物，可特異性殺死LHRH受體陽性癌細胞。本文介紹了EP-100的特性，包括與LHRH受體結合的特異性、作用機製、腫瘤細胞係的篩選、細胞係與LHRH受體表達水平的相關性在活的有機體內功效。

方法:通過飽和結合研究評估EP-100與LHRH受體的結合動力學。用熒光LHRH偶聯物標記後的免疫組化和共聚焦顯微鏡檢測人癌細胞株和腫瘤組織上的LHRH受體。在體外通過細胞活力測定評估了包括卵巢、乳腺、子宮內膜、前列腺、胰腺和子宮肉瘤細胞係在內的人類癌細胞係的細胞毒性篩選。在活的有機體內通過係統注射EP-100到卵巢癌移植小鼠中進行療效研究。通過組織學評價、腫瘤標誌物CA-125測定和PET成像評價療效。

結果:這些EP-100的研究表明，EP-100對LHRH受體具有高親和力結合，在人癌細胞係中具有細胞毒性和特異性在體外在低微臼齒水平。EP-100通過膜破壞在數小時內快速摧毀LHRH受體陽性癌細胞。在活的有機體內單次和重複給藥的研究表明，0.2 mg/kg的EP-100劑量可使卵巢癌異種移植瘤消退，安全且對重要器官和紅細胞無影響。非靶向溶肽無效果在體外而且在活的有機體內．EP-100通過壞死殺死腫瘤。各治療組均通過PET顯像和腫瘤標誌物(CA-125)降低證實腫瘤死亡。

結論:EP-100對癌細胞的作用明顯在體外而且在活的有機體內展示了一種新設計的靶向合成陽離子多肽的特性和作用機製，該多肽具有顯著的活性，可通過裂解癌細胞細胞膜導致壞死，特異性地破壞表達LHRH受體的卵巢癌細胞。EP-100是治療卵巢癌的合適候選藥物。

關鍵字

卵巢癌;裂解肽;靶向治療;針對裂解肽;LHRH;LHRH受體

縮寫

LHRH:促黃體生成素釋放激素;LH:促黃體激素;卵泡刺激素:促卵泡激素;寵物:Positronemission斷層;CT:計算機斷層掃描

簡介

卵巢癌是癌症死亡的第五大原因，有14,080例(5%)，而19.5萬名婦女仍患有這種疾病[1]。盡管接受了腫瘤消融和嚴格的化療幹預，每年確診的2.2萬名卵巢癌女性中仍有70%死於癌症。通常，由於症狀不明確和缺乏有效的篩查方法，診斷發生在晚期。如果診斷為遠處轉移性[1]，隻有27%的卵巢癌患者存活5年。

卵巢癌去體積手術後的標準護理(SOC)治療是通用鉑藥、紫杉醇、依托泊苷、吉西他濱、脂質體阿黴素(Doxil)^®/Caelyx)和topotecan[2]，產生了低於18個月[3]的低回複率。2014年，貝伐珠單抗(Avastin^®盡管其無進展生存期(PFS)獲益不能轉化為總生存期(OS)獲益[4]，但FDA快速批準了該藥物用於複發性鉑難治性患者。最近，parp抑製劑等靶向療法在一組顯示BRCA突變的卵巢癌患者中顯示了應答[5,6]。使用非靶向化合物(卡鉑、紫杉醇、多克西汀)進行全身治療會產生嚴重的副作用，而且不能區分重要器官中的癌細胞和正常細胞。它們被設計用來殺死快速分裂的細胞，而對殺死非分裂轉移性癌細胞無效，非分裂轉移性癌細胞是癌症相關死亡的主要原因。出現多藥耐藥的患者腫瘤，通常表現為更具侵襲性和致命性的疾病形式。對於那些沒有其他選擇的患者來說，需要使用具有獨特作用機製、專門針對癌細胞的新藥來治療。

通過LHRH受體靶向癌細胞

癌細胞研究最多的靶點之一是黃體生成素釋放(LHRH)受體。一些最常發生的癌症過表達LHRH受體;這些癌症包括卵巢癌(80%)、乳腺癌(52%)、子宮內膜癌(80%)、前列腺癌(80%)、腎癌、胰腺癌(62%)、結腸癌和血液係統惡性腫瘤(94%)[7-10]。

因此，通過LHRH結合傳遞毒素的研究仍在繼續深入，LHRH受體靶向的概念和基本原理已經建立。LHRH受體一般存在於細胞膜表麵，在癌細胞上過表達，而在除垂體和性腺外的正常組織中不表達[11,12]。一些研究報告了lhrh毒素結合物的臨床前概念證明，如牛RNaseA[13]美洲商陸蛋白[14]和假單胞菌外毒素[15]，細胞凋亡相關蛋白，如BIK, BAK, BAX和DFF40[16]。化療藥物如阿黴素[10]、紫杉醇[17]、美法蘭、順鉑和甲氨蝶呤已與LHRH結合[18,19]。阿黴素結合物與LHRH激動劑(AEZS-108, Zoptarelin阿黴素，Aeterna Zentaris)目前正在子宮內膜癌[10]的III期臨床試驗中。佐塔雷林、阿黴素和其他LHRH毒素結合物需要複雜的化學合成，並涉及優化的連接器技術，以釋放毒素在靶細胞內發揮活性。

裂解肽通過新的作用機製殺死癌細胞

一種殺死癌細胞的替代方法已經開發出來，使用具有獨特和新穎的作用機製的靶向溶肽。溶解肽在自然界中大量存在，是細菌、植物、昆蟲、無脊椎動物、脊椎動物和人類的防禦分子[20-23]。它們由9-60個氨基酸組成，可以是陰離子或陽離子、線性或環狀，並共享兩親性結構，使它們能夠與帶相反電荷的細胞膜結構相互作用和插入[20-22]。α -螺旋陽離子裂解肽的例子有昆蟲的天蠶素和蜂毒素，兩棲動物的magainin, dermaseptin，人類的抗菌肽，顆粒素，穿孔素，防禦素4。所有這些溶解肽都與細菌或癌細胞的帶負電荷的膜相互作用，通過膜溶解引起細胞死亡。天然裂解肽缺乏細胞選擇性，其溶血活性和抗原性限製了其臨床應用。通過對水解肽設計的深入研究，合成了由L和D氨基酸或氨基酸類似物組成的水解肽，以增加穩定性。這些努力產生了合成的溶解肽，增強了對癌細胞的活性，降低了溶血活性和缺乏免疫原性[24-28]。它們通常具有α螺旋陽離子結構，能迅速裂解帶負電的膜。殺死細胞的作用機製各不相同，取決於溶解肽的組成和序列。 Lytic peptides that kill by necrosis are generally not internalized. Others maybe internalized and have been shown to elicit apoptosis [23]. Because these lytic peptides were not targeted, their在活的有機體內應用僅限於直接注射到腫瘤中，在治療動物中觀察到壞死和免疫細胞浸潤。到目前為止，隻有一種非靶向的溶解肽在臨床試驗中進行了測試。乳鐵蛋白合成的溶解肽LTX-315已通過瘤內注射在實體腫瘤中進行臨床試驗[27-30]。

通過結合靶向配體或癌細胞上受體過表達的抗體，可進一步提高溶肽活性[31-40]。這種方法不僅提高了抗癌活性，還允許全身注射，在各種異種移植小鼠模型中產生對抗原發腫瘤和轉移的活性[34,41-49]。

第一個選擇性癌症靶向肽由合成的溶解肽(Phor14, Hecate和後來的Phor21)組成，這些水解肽與靶向人絨毛膜促性腺激素(hCG)受體和LHRH受體的肽結合[42-49]。這些化合物能迅速而特異地殺死過表達hCG或LHRH受體的細胞。與細胞膜的直接接觸和相互作用導致細胞膜的破壞和壞死死亡。前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的動物模型實驗表明，在三周靜脈注射Hecate和Phor14結合物10 mg/kg的劑量，以及Phor- 21-β cg 0.2 mg/kg的劑量後，這些化合物可使腫瘤消退[33,43-47]。這些結合物不會引起全身毒性，不具有抗原性，即使半衰期小於10分鍾[50]也具有高效力。它們還能殺死耐多藥的癌細胞，這是現有癌症化療的優勢。與目前正在開發的其他靶向小分子或抗體藥物偶聯物不同[9,17,51,52]，裂解肽偶聯物在接觸細胞時即可殺死細胞，無需內化或裂解即可獲得對目標細胞的活性。

為了臨床開發，設計、合成和測試了一種針對LHRH受體的新型、更有效的溶細胞肽綴合物，以增加對癌細胞的毒性和特異性，而不傷害紅細胞。這些研究導致了針對癌細胞上LHRH受體的EP-100的開發。EP-100是一個28個氨基酸的肽(MW= 3317 g/mol)，由黃體生成素釋放激素的自然激素序列組成，與一個18個氨基酸的溶解肽(稱為CLIP71)相連，沒有連接子(圖1)。EP-100靶向並特異性殺死過表達LHRH受體的癌細胞通過一種涉及直接膜破壞和壞死的新作用機製。裂解區域，CLIP71，是一個線性，α螺旋，陽離子，兩親膜破壞肽。臨床前研究證實了對LHRH受體表達細胞係的細胞毒性，並證實了與標準抗癌藥物的協同作用和逆轉耐藥性[53-55]。這些良好的療效和安全性促使EP-100進一步開展臨床試驗。EP-100單藥應用於實體瘤患者(NCT0094955)和EP-100聯合紫杉醇應用於晚期卵巢癌患者(NCT01485848)[56,57]。在總共87例患者接受長達18個月的治療後，觀察到顯著的安全性和耐受性。

圖1:EP-100的結構公式。

本文報告了在臨床研究之前進行的臨床前數據。大多數數據都包含在IND的數據收集中。從那時起，產生了更多的數據，並包括在本臨床前出版物中。

本文介紹了EP-100的臨床前研究，包括作用機製、與LHRH受體結合的特異性、結合動力學等方麵的研究在體外對實體瘤(卵巢、乳腺、子宮內膜、前列腺、胰腺、黑色素瘤和子宮肉瘤)的人類癌細胞係進行細胞毒性研究，以確定潛在的適應症。對其作用機理和藥代動力學進行了研究在體外．測定了EP-100與LHRH受體的結合參數。在18個人體實體腫瘤細胞株上評估了EP-100與LHRH受體的特異性和效力。作為一個例子在活的有機體內包括卵巢癌異種移植的療效研究和結果。

材料

細胞係來自弗吉尼亞州馬納薩斯的American Type Cell Culture Collection。EP-100、CLIP71和FITC-D-Lys⁶- lhrh通過標準固相化學方法與Fmoc [Nα-(9-氟基甲氧基羰基)]合成，並由美國肽公司(森尼維爾，加利福尼亞州)通過標準反相高壓液相色譜(HPLC)純化，並以水解形式提供。EP-100的合成方法是美國肽公司的專利。

方法

EP-100與LHRH受體的結合

通過飽和結合研究評估了EP-100與LHRH受體的結合動力學。如Leuschner等人所述，使用由0.3M蔗糖、1 mM EDTA、0.025 mM PMSF、1 mM DTT、2µg/ml抑肽蛋白和25 mM Tris、pH 7.5包含0.2% BSA[46]組成的結合緩衝液進行檢測。小瓶塗上含有2.5%牛血清白蛋白的孵育緩衝液過夜。使用30µg的膜製劑(Millipore ChemiScreen)確定特異性結合^™人GnRH受體I, HTS027M，批號JH1424114, Millipore, Inc, Billerica, MA)和子宮肉瘤細胞係MES-SA-Dx5的膜製劑。按照Leuschner等人的描述製備膜。在LHRH類似物Triptorelin (APC 54- 1-21, lot # R02030A1)或leuprolide (Sigma L0399, lot # SLBC4150V)濃度不斷增加的情況下，使用75,000 cpm的125-I-D-Trp6 -LHRH (NEX 365010UC, lot # IZ41230, Perkin Elmer)進行結合，並與EP-100 (APC338613, lot # w01007c1)進行比較。非特異性結合是用1000倍未標記化合物測定的。反應混合物(100µl)的膜在冰上孵育90分鍾，加入1 ml冰冷結合緩衝液結束反應，以19,500xg離心，用結合緩衝液洗滌三次。結合的放射性標簽是用伽馬計數器測定的。結合使用Graph Pad Prizm 5™飽和結合動力學分析程序進行計算。

作用機製的確定

利用共聚焦熒光顯微鏡，用2種不同的方法測定了EP-100對癌細胞的膜作用。首先，將人類黑色素瘤細胞(MDA-MB-435S)以10000個細胞的密度播種到培養皿中，用熒光染料(DRAQ5)對細胞核和線粒體進行染色^™(Alexis Corporation, USA) - blue和MitoTracker^®Red CMXRos (M7512)分子探針公司或者,美國)。用小麥胚芽Alexa Fluor green偶聯物對細胞膜進行染色。或者,美國)。

在生理鹽水中加入終濃度為10µM的重組EP-100孵育5 ~ 60分鍾。鹽水培養皿僅作為對照。

MDA-MB-435S和Skov-3在塗有聚L-賴氨酸的玻璃罩卡片上生長至80%合流。細胞用1µM Mitotracker Red CMXRos染色，線粒體(InVitrogen lot# 513724)和500 nM DAPI染色，細胞核(InVitrogen lot# 493001)在37°C生長培養基中染色30分鍾。將生理鹽水(未處理對照組)或2µM FITC標記的EP-100 (APC lot# W10051C1)在37℃下加入細胞，時間為2 - 30分鍾。使用熒光氧化還原標記JC-1在5µM下，在5µM的EP-100或生理鹽水存在下，研究線粒體的極化/去極化，並與線粒體去極化劑原胞體間氯苯腙CCCP (1 mM)進行比較。細胞固定在4%的溶解於生長培養基中的多聚甲醛中。成像使用蔡司共聚焦顯微鏡和3I Everest成像係統，放大倍數分別為40倍和63倍。

人癌細胞係LHRH受體的定量研究

細胞以10000個細胞/孔的密度播種到腔載玻片中。融合的單分子膜固定在10%磷酸鹽緩衝福爾馬林中，連續脫水後保存在乙醇中。使用小鼠LHRH受體單克隆抗體(GNRH03， #MS-1139-P, LabVision)進行免疫過氧化物酶染色，並在Ventana XT、Ventana Benchmark或Ventana Nexes Units上分析。圖像分析使用Ventana圖像分析係統(VIAS)輔助計算機輔助圖像分析係統，該係統功能連接到交互式顯微鏡(Axio Imager)。采用Her2/neu受體定量程序進行定量分析，包括形態學和比色分析。LHRH受體狀態結果以膜染色陽性細胞的百分比報告，其標準如下:0個無免疫反應細胞，1+:1-25%陽性細胞，2+26 - 50%陽性細胞，3+51-75%陽性細胞。將這些數據與人工評估的染色強度進行比較。

用共聚焦顯微鏡檢測細胞係中的LHRH受體

FITC-D-Lys⁶-LHRH (APC 365254, lot 1302084C)用於檢測濃度為2 μ M的福爾馬林固定單分子膜表麵LHRH受體，FITC孵育作為對照。細胞核用DAPI染色。

細胞係中LHRH受體的mrna表達

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen #74104，來源)從細胞培養物中分離RNA，使用Agilent 2100生物分析儀進行定量和完整性分析。來自卵巢癌細胞係OVCAR-3的總RNA被用於標準曲線。利用引物表達軟件(Applied Biosystems)設計Taqman PCR引物，並在LHRH-R中探測編碼2-24氨基酸的匹配核苷酸，LHRH-R是一個與激素結合有關的高度保守區域。

逆轉錄酶和PCR一步反應，第一步用反向引物特異性引物合成LHRH-R cDNA。所有標準品和樣品均使用相同的反應混合物，每個樣品均測定三份。實時RTPCR反應在96孔光學板(ABI #4306737)和MicroAmp光學膠膜(ABI #4311971)中進行，在ABI 7900序列檢測係統中，第一個反應階段設置為48°C 30分鍾，進行cDNA合成步驟。每次反應使用50ng細胞RNA。基於Agilent定量樣本總RNA濃度歸一化靶基因mRNA水平。

在體外篩選:人類癌細胞係包括:卵巢癌細胞係(OVCAR-3、SKOV-3、A2780)、乳腺癌細胞係(MDAMB-231、BT474、SKBR-3、MCF-7、T47D)、子宮內膜癌細胞係(Hec1A和An3-CA)、前列腺癌細胞係(PC-3、LnCaP)、胰腺癌細胞係(Panc-1、BxPC-3、MiaPaCa)、腎癌細胞係A498、黑色素瘤細胞係(MDA-MB-435S)和人子宮肉瘤細胞係的多藥克隆med - sa - dx5。LHRH受體陰性細胞係，如人卵巢癌細胞係SKOV-3，和兩種非癌上皮細胞係，小鼠成纖維細胞細胞係3T3和人乳腺上皮細胞係MCF-10A作為靶受體的陰性對照。細胞以2000 - 10000細胞/孔的數量接種於96孔板中。48 h後，將溶解於生理鹽水中的EP-100或非共軛溶解肽(CLIP71)分別以0、0.001、0.01、0.1、1、2、5、10和100 μ M的濃度添加到多孔板中。細胞在37°c下孵育4或24小時，通過觀察細胞在15和30分鍾、1、2、4和24小時後的活力來確定活性動力學。細胞活力采用福瑪讚轉化測定法(MTT測定法)或光度細胞活力測定法(Cell- titer - glo, Promega, Madison, WI)測定。使用死細胞蛋白酶光度法測定膜完整性(Cytotox-Glo, Promega, Madison, WI)。對照組使用USP鹽水或0.1% TritonX-100^™分別作為0和100%細胞死亡的參考。使用Graph Pad Prizm 4™軟件和Graph Pad Prizm 5™(Graph Pad Prizm, Inc)處理和分析數據。顯著性的統計分析采用雙尾Student 's t檢驗。

在活的有機體內研究:在活的有機體內該研究由洛杉磯巴吞魯日彭寧頓生物醫學研究中心機構護理和使用委員會批準，第372和543P號議定書。

人卵巢癌異種移植模型

在5周齡雌性裸小鼠(Balbc/NuNu)體內注射4 × 10 SC誘導腫瘤⁶NIH:OVCAR-3細胞懸浮在Matrigel™中(文章# 34)。EP-100 (apc338913，地段號。V09108X1)在生理鹽水中新鮮重組，在腫瘤細胞接種後第33、41和47天以0.02、0.2或2 mg/ kg的劑量靜脈注射。另一組小鼠分別在第33、34和35天以3 mg/kg劑量給予順鉑。對照組給予生理鹽水或非共軛溶解肽CLIP-71 (2mg/kg)。第33天處死一組未處理的荷瘤小鼠作為基線對照。所有其他小鼠在第51或52天被處死，用於評估腫瘤和血清腫瘤標誌物CA-125水平。使用酶聯免疫分析法從每隻小鼠屍檢時收集的血清中測定CA-125，用於定量測定卵巢癌抗原CA-125 (Genway, Biotech, Inc.)加州聖地亞哥，目錄#40-052-115009，#BC- 1013根據製造商)。

異種移植小鼠的pet成像

以NIH:OVCAR-3腫瘤細胞(傳代號為48)SC作為基質進行異種移植^™將懸液注入雌性裸鼠(Balbc/NuNu, 5周齡)。EP-100 (APC 338913，批次號P080401)在劑量濃度為0.04 mg/ml的生理鹽水中重組，用於尾側靜脈注射。在腫瘤細胞注射後第38天開始0.2 mg/kg劑量的治療(N=16)，並持續到第41、44、48、52、59和61天。鹽水注射小鼠作為對照組(N=13)。記錄腫瘤體積和體重。腫瘤接種後第85天，處死小鼠，稱取腫瘤，用福爾馬林固定。第78天，生理鹽水對照組和EP-100治療組4隻小鼠進行PET-CT成像腫瘤評估。隔夜禁食小鼠注射0.2 μ Ci [¹⁸F]-2-氟-2-脫氧-d -葡萄糖(FDG) 0.1 ml滴入尾側靜脈。處死小鼠1小時後進行PET/CT成像。

統計分析

采用雙尾學生t檢驗、單向方差分析(ANOVA)、雙尾學生t檢驗和Tukey-Kramer多重比較檢驗對數據進行統計分析，以確定平均數之間的顯著性。使用Graph Pad Prizm 5進行分析計算^™和Instat 3 (Graph Pad Prizm, Inc)。

結果

EP-100是由與LHRH結合的裂解部分CLIP71(18個氨基酸)組成的28個氨基酸溶肽共軛物，分子式為C₁₆₃H₂₄₃N₄₃O₃₂分子量為3317.3道爾頓。圖1為EP-100的結構公式。它產生一種白色到灰白色的凍幹物質，很容易溶解在水或親水性緩衝液中。

EP-100與LHRH受體的結合

在飽和結合實驗中測定了EP-100的結合動力學，並與兩種LHRH類似物Triptorelin和Leuprolide進行了比較。LHRH的類似物Triptorelin被使用，因為6號位置上的d -色氨酸增加了它的穩定性。此外，Triptorelin與LHRH受體的特異性結合與天然LHRH[58]相似。Chem1-LHRH RI轉染細胞膜與Mes-SA-Dx5細胞膜的結合參數如表1所示。關聯的綁定參數(K_D)和能力(B_馬克斯)對LHRH受體的影響與雷公藤relin、亮丙林德和EP-100相似，它們都在Chem 1-LHRH R I轉染細胞的細胞膜上取代了放射性標記的雷公藤relin(圖2A)。綁定能力(B_馬克斯)和親和力(K_D)采用Scatchard分析測定。一個結合位點被K識別_D2.2±0.2 nM_馬克斯雷公藤肽蛋白1538±214 fmol/mg, 2.1±0.1 nM, B_馬克斯亮丙啉蛋白為1395±282 fmol/mg。EP-100與K的結合參數相似_D2.9±0.1 nM_馬克斯蛋白質含量為1358±337 fmol/mg。子宮肉瘤細胞係(Mes-SA-Dx5)膜上的結合參數顯示，與K的LHRH受體有親和力的單一結合位點_Dp -100的結合能力為4.1±0.3 nM_馬克斯)為1600±256和1851±281 fmol/mg蛋白質(圖2B)。EP-100與LHRH受體具有高親和力，並以劑量依賴的方式取代放射性標記的雷公藤肽。結合電位(B_馬克斯/ K_D)對於單個化合物而言，Chem-1膜為686.6和635.1，雷普托雷素和亮丙啉，EP-100為477.6。在Mes-SA-Dx5膜上，Triptorelin和EP-100的結合電位分別為427.8和451.5。結果表明，EP-100與LHRH受體具有高親和力。

圖2:A) I的飽和結合曲線¹²⁵-D-Trp⁶從LHRH受體I轉染的chem1細胞係細胞膜上提取-LHRH，並插入Scatchard圖。曲普瑞林:K_D2.2±0.2 nM, B_馬克斯1538±214 fmol/mg蛋白質，亮丙酸鈉:K_D2.1±0.1 nM, B_馬克斯蛋白質1395±282 fmol/mg, EP-100: K_D2.9±0.1 nM, B_馬克斯1358±337 fmol /毫克的蛋白質。B) I的飽和結合曲線¹²⁵-D-Trp6 -LHRH位於子宮肉瘤細胞係(Mes-SA-Dx5)細胞膜上，並插入Scatchard圖。曲普瑞林:K_D3.7±0.4 nM, B_馬克斯蛋白質1600±256 fmol/mg, EP-100: K_D4.1±0.3 nM, B_馬克斯1851±281 fmol /毫克的蛋白質。

綁定參數	ep - 100	曲普瑞林	Leuprolide
Chem1-LHRH國際扶輪
KD(納米)	2.9±0.1	2.24±0.2	2.14±0.1
B馬克斯(fmol /毫克蛋白)	1385±337	1538±214	1395±282
Mes-SA-Dx5
KD(納米)	4.09±0.3	3.74	不確定
B馬克斯(fmol /毫克蛋白)	1851±281	1600±256	不確定

表1:通過Scatchard分析計算出EP-100和LHRH類似物在Chem1- LHRH RI和Mes-SA-Dx5膜製劑上的結合參數。

用熒光標記配體檢測癌細胞株上的LHRH受體

使用FITC-D-Lys在共聚焦顯微鏡圖像中觀察了3個卵巢癌細胞係上的LHRH受體⁶-LHRH為LHRH受體，FITC染色為對照。圖3的上麵板顯示了FITC培養單分子層的背景染色，這三種細胞係都相似。圖3下圖為卵巢癌細胞株OVCAR-3和A2780表麵染色為綠色。卵巢癌細胞係SKOV-3隻顯示核染色(藍色)，而LHRH受體無法檢測到，因為沒有代表LHRH受體的綠色標簽。

圖3:共聚焦顯微鏡通過結合D-Lys-FITC-LHRH在癌細胞表麵檢測LHRH受體。固定單層卵巢癌細胞株用2µM DLys-FITC-LHRH或FITC孵育30分鍾，DAPI進行核染色。FITC對照染色隻顯示背景標記，SKOV-3、OVCAR-3和A2780細胞係的情況類似。綠色FITC標記(LHRH受體陽性)存在於OVCAR-3和A2780兩個卵巢癌細胞係中。卵巢癌細胞係SKOV-3檢測LHRH受體陰性。

在體外EP-100對人類癌細胞株的細胞毒性

篩選來自子宮肉瘤(1)、乳腺癌(5)、前列腺癌(2)、卵巢癌(3)、子宮內膜癌(2)、腎癌(1)、黑色素瘤(1)和胰腺癌(3)實體腫瘤的18個人類癌細胞株，得到最大效力的IC₅₀4小時後，EP-100在0.6-6.6 μ M的低微摩爾水平下的值，24小時後無進一步下降(表2)。小鼠成纖維細胞3T3和乳腺上皮細胞MCF- 10A在4或24小時後均未被EP-100或CLIP71殺死。相比之下，未結合的CLIP71在4小時後的活性範圍為13.7-181 μ M, 24小時後的活性範圍為11.2-109 μ M，或者完全沒有毒性。CLIP71作用4小時後，PC-3前列腺細胞和BT-474乳腺癌細胞均未被CLIP71殺死。LHRH受體陰性的人卵巢癌細胞株SKOV-3對EP-100和CLIP71具有類似的敏感性₅₀4h後50.5±5.3 μ M 49.2±3.8 μ M, 24h後21.1±0.9 μ M 28.2±4.9 μ M。ep100對表達LHRH受體的ms - sa - dx5(0.58±0.009 μ M, 230.62±0.009 μ M)、OVCAR-3(5.8±0.3 μ M, 3.0±0.5 μ M)和bet -474(6.6±0.03 μ M, 0.9±0.02 μ M)等多藥耐藥腫瘤細胞株在低微摩爾水平均有效，但對LHRH受體陰性的SKOV-3細胞無效。EP-100和CLIP71對非癌小鼠成纖維細胞NIH-3T3 (LHRH受體陰性)在4小時後未被殺死，24小時後對這兩種化合物的敏感性相似，分別為121.2±16.5 μ M和102.7±6.8 μ M。人乳腺上皮細胞係MCF-10A對EP-100和CLIP71具有耐藥性₅₀24小時後分別為15.3±2.5 μ M和22.6±2.5 μ M(表2)。未共軛溶解肽CLIP71對具有IC的癌細胞株的毒性降低了20倍以上₅₀值在4小時後的13.7-181 μ M和24小時後的11.2-109 μ M之間(表2)。對於LHRH受體陽性細胞株，完全療效在4小時後達到，當LHRH受體陽性細胞株在24小時後測量細胞死亡時，沒有進一步增加。

細胞行	集成電路50[μ M] 4 h EP-100	集成電路50[μ M] 24 h EP-100	集成電路50[µM] 4 h Clip-71	集成電路50[µM] 24 h Clip-71
子宮肉瘤
MES-SA-Dx5	0.58±0.009	0.62±0.01	13.75±0.16	11.2±1.1
黑素瘤
mda - mb - 435	0.59±0.001	0.62±0.002	38.02±8.5	27.4±3.1
乳腺癌
mda - mb - 231	3.4±0.02	0.56±0.05	50.3±1.7	13.6±0.8
SK-BR-3	5.4±0.5	1.6±0.07	25.5±0.24	12.3±0.1
bt - 474	6.6±0.03	0.9±0.02	> 1000	91.7±8.5
MCF-7	3.05±0.6	1.02±0.02	92±10	44.3±2.5
T47D	ND	0.9±0.16	ND	32.3±1.2
子宮內膜癌
An3-CA	ND	3.8±0.08	ND	ND
Hec-1A	ND	10.3±1	ND	ND
前列腺癌
曲澤寫明ATCC	3.3±0.8	4.9±0.2	不是有毒	56.8±0.9
LNCaP	1.9±0.3	1.55±0.08	181.5±13.5	46.5±2.5
胰腺癌
Panc-1	ND	5.4±1.34	ND	ND
Bx-PC-3	ND	4.1±0.76	ND	ND
MiaPaCa	4.07±0.17	1.61±0.11	44.3±9.9	44.4±2.9
卵巢癌
OVCAR-3	5.8±0.3	3±0.5	36.45±1.4	12.4±1.5
A2780	ND	2.02±0.09	ND	ND
SKOV-3	50.5±5.3	21.1±0.9	49.2±3.8	28.2±4.9
腎髒癌症
A498	ND	2.5±0.5	ND	ND
解釋:
3 t3	> 1000	121.2±16.5	> 1000	102.7±6.8
MCF-10A	ND	15.3±2.5	ND	22.6±2.5

表2:EP-100和CLIP71在4和24小時後對各種細胞係的作用。數據以IC表示₅₀Hill Plot分析中[μ M]的值。ND =不確定。

與CLIP71相比，在LHRH受體陽性細胞係中，EP-100的活性在4小時和24小時後分別增加了23倍和28.5倍。癌症細胞係和非癌症細胞係之間活性的中位數差異為50倍。

在競爭實驗中進一步證實了EP-100對細胞表麵LHRH受體的特異性在體外將MDA-MB-435S人類黑色素瘤細胞與EP-100一起培養，同時加入濃度不斷增加的LHRH類似物——雷普托雷林。

雷公藤雷公素孵育細胞後，細胞活力顯著增加(即2.5 μ M給藥時EP-100的細胞毒性顯著降低)，且呈濃度依賴性，從不含LHRH時的13.5±0.6%增加到35.8±2.7% (p<0.0002)、48.3±4.2% (p<0.0001)、55.1±7.1% (p<0.0001)， 100 μ M LHRH存在時的81.12±3.07% (p<0.0001)(圖4)。這些結果表明，EP-100的細胞毒性是由其與LHRH受體的相互作用調節的。在存在LHRH類似物的胰腺癌細胞係中也得到了類似的結果(數據未顯示)。

圖4:LHRH類似物Triptorelin對EP-100在黑色素瘤細胞係MDA- MB-435S中的療效的影響。在添加濃度為2.5、10、50和100 μ M的Triptorelin時，添加濃度為2.5 μ M的EP-100。

的作用機製

用共聚焦熒光顯微鏡進一步評估了EP-100對表達功能性LHRH受體的癌細胞的快速作用特性。其中一種作用機製被描述為通過陽離子細胞溶解肽與帶負電荷的癌細胞膜接觸而使膜解體。另一種機製被描述為線粒體通過內化的裂解肽去極化。用兩種方法來確定EP-100在微摩爾濃度下的作用機製在體外: 1。EP-100作用於MDA-MB-435S黑素瘤細胞係，通過熒光標記和2。熒光標記的EP-100用於LHRH受體陽性和LHRH受體陰性細胞係的時間過程實驗，其中細胞核、線粒體和EP-100用熒光標記標記。人黑素瘤細胞係MDA-MB-435S的漿細胞膜在接觸10µM EP-100數分鍾後顯示明顯的崩解，這表明EP-100在這種表達LHRH受體的細胞係中迅速開始了細胞毒性作用(圖5B-5D)。經生理鹽水處理的細胞未見明顯效果(圖5A)。在第二個實驗中，將2 μ M熒光標記的EP-100添加到SKOV- 3細胞(LHRH R陰性，圖5E)和MDA-MB-435S細胞(LHRH R陽性，圖5F)，共聚焦顯微鏡顯示，黑色素瘤細胞係早在2分鍾時就出現了膜崩解，但也有一些細胞內攝取。早在30分鍾就觀察到質膜起泡，外膜形成囊泡，線粒體染料褪色，提示細胞複合體滲漏(圖5F)。隻有在SKOV-3細胞係中，這種影響是最小的，細胞表麵吸附EP-100，線粒體標記沒有任何褪色(圖5E)。由KLAK序列組成的溶肽被描述為線粒體毒素，因為它們去極化線粒體膜。用JC-1熒光指示劑檢測EP-100對線粒體去極化的影響。 JC-1 is a cationic dye that is widely used to detect mitochondrial membrane potential. The accumulation of JC-1 in polarized mitochondria and emission of red fluorescence (590 nm) is membrane potential dependent. Upon depolarization of mitochondria, JC-1 diffuses into the cell cytoplasm and emits green fluorescence (529 nm).

圖5:EP-100的作用機理。MDA-MB-435S的熒光共聚焦顯微圖。Luc黑色素瘤細胞(綠色膜，紅色線粒體和藍色核染色)。MDA-MB-435S膜完整性的比較。在生理鹽水(A)和暴露於EP-100後5分鍾(B)、30分鍾(C)和60分鍾(D)。細胞膜在EP-100的存在下迅速解體，導致細胞在60分鍾後死亡。E) LHRH受體陰性的SKOV-3細胞和F) LHRH受體陽性的MDA-MB-435S。暴露於FITCEP-100的luc細胞。與LHRH受體陽性MDA-MB-435S結合。可見Luc細胞膜和崩解。在對照組(G)和EP-100 (H)暴露的MDA-MB-435S中，JC-1染色的黑色素瘤細胞的膜去極化。與線粒體去極化劑相比，CCCP (I)在EP-100暴露後顯示線粒體膜去極化缺失。

在用sc -1染色的未處理對照MDA-MB- 435S細胞共聚焦顯微鏡圖像中，鮮紅色線粒體清晰可見，彌漫綠色細胞質染色圖5G。EP-100處理30分鍾後，紅色線粒體染色幾乎無明顯損失(圖5H)。cccp處理的細胞失去了明顯的紅色線粒體染色，顯示彌漫性橙色細胞質染色，而不是預期的綠色細胞質染色(圖5I)。

這些觀察結果表明，EP-100特異性地在暴露數分鍾內導致LHRH受體陽性MDA-MB-435S細胞的膜破壞，而不改變線粒體的膜電位。暴露於EP-100後，LHRH受體陰性的SKOV-3細胞保持完整。

腫瘤細胞係中LHRH受體表達與療效的相關性

EP-100與細胞表麵的LHRH受體具有高親和力結合，殺死與細胞膜接觸的細胞。LHRH受體已在細胞表麵、細胞質和細胞核上發現[59,60]。免疫組化檢測靶癌細胞是否在細胞表麵表達LHRH受體。通過免疫組化，使用一種針對LHRH受體的市售單克隆抗體，檢測LHRH受體在癌細胞和非癌細胞上的表達。該方法用於測定作為EP-100功能靶點的表麵受體的表達。使用計算機輔助成像程序對表麵受體水平進行量化，該程序為每個細胞係生成從0、1+、2+和3+的VIAS評分數字。人卵巢癌細胞係SKOV-3和子宮內膜癌細胞係KLE和Hec1A檢測LHRH表麵受體陰性，VIAS評分為0。卵巢癌細胞係OVCAR-3的VIAS評分為(2+);乳腺癌細胞係T47 D為(1+)，MCF-7為(3+)，黑色素瘤細胞係MDAMB-435S為(3+)，前列腺癌細胞係PC-3為(2+)。以MCF-10A乳腺上皮細胞(0)和3T3小鼠成纖維細胞(0)為代表的兩種非癌細胞係對LHRH受體呈陰性。

LHRH受體水平與EP-100敏感性的相關性通過文獻值對選定細胞係中的LHRH受體水平進行評估(圖6A) [Leuschner，未發表數據;46,51,61,62]和通過IHC測定的受體水平作為VIAS評分(圖6B)。兩種方法的結果都是與R的線性關係²數值在0.64-0.82之間，表明受體表達水平越高，對EP-100的敏感性越高(圖6A和6B)。靶細胞的敏感性取決於靶受體的存在。

圖6:A)基於免疫組化後Ventana圖像分析係統(VIAS)評分的腫瘤細胞EP-100敏感性和B)與基於Scatchard分析的文獻報道的LHRH受體能力的相關性[46,51,59,61]。用EP-100孵育24小時，人癌細胞株對EP-100表現出不同的敏感性，這與LHRH受體的能力和VIAS評分與r相關²值為0.64和0.82。以lhrh受體陰性細胞係SKOV-3作為特異性的測定指標。免疫組化未檢測到LHRH受體的SKOV-3和Hec 1A細胞對EP-100處理不敏感。C)各種人癌細胞係和小鼠成纖維細胞3T3細胞的mRNA表達水平作為陰性對照。相對mRNA水平在10到160之間。D)單個細胞係LHRH受體的mRNA水平與它們對微摩爾IC表達的EP-100的敏感性的相關性₅₀值。LHRH受體mRNA水平與EP-100敏感性無相關性²= 10⁶）.

基於mRNA水平的LHRH受體表達在包括SKOV-3細胞在內的細胞係中顯示出不同的表達水平(圖6C)，但與細胞對EP-100的敏感性沒有相關性(圖6D)，這表明靶細胞的識別不能依賴於分子生物學檢測，而是必須通過免疫組化方法或直接結合配體來確認表麵受體。

細胞毒性動力學

EP-100在暴露4小時後顯示出最大活性在體外(表2)。在LHRH受體陽性卵巢癌細胞係(OVCAR-3)中評估EP-100與CLIP71的活性圖譜，並與LHRH受體陰性卵巢癌細胞係(SKOV-3)進行比較。本研究還通過比較EP-100與非共軛溶解肽CLIP71的作用來評估LHRH受體靶向的作用。EP-100通過受體靶向機製在1小時內殺傷癌細胞的能力最強，遠遠優於CLIP71。

在OVCAR-3細胞(p34)中，EP-100在孵育4小時後達到最大效力(IC₅₀5min後[µM]為6.7±0.01;15分鍾後5.7±0.05;30分鍾後5.3±0.05;1小時後1.6±0.06,2小時後1.5±0.04,4小時後0.58±0.01,24小時後0.55±0.001)。相比之下，CLIP71在相同時間點對IC的敏感性降低了40- 50倍₅₀值[µM]為5min後337±33.5,15min後126±10.9,85.5±15.5 (30min)， 71.5±6.0 (1 h)， 52.5±3.5 (2 h)， 23.1±1.0 (p<0.005)。LHRH受體陰性SKOV-3細胞株發生IC₅₀p -100在95.2±0.8(15分鍾)，89.8±3.6(1小時)，90.8±2.6(2小時)，78.1±11.5(4小時)和11.5±1 24小時後的µM。對SKOV-3細胞的敏感性與CLIP71相似，分別為93.2±6.3(15分鍾)、86.7±2.5(1小時)、59.8±0.14(2小時)、75.4±7.8(4小時)和50.8±0.04 μ M。與未偶聯肽CLIP71相比，EP-100對LHRH受體陽性癌細胞的作用快(圖7A)，在LHRH受體陽性細胞係中的作用強40- 50倍。LHRH受體陰性的SKOV-3細胞係對EP- 100和CLIP71表現出類似的動力學特征(圖7B)。

圖7:EP-100和CLIP71在2個卵巢癌細胞係中的動力學在體外呈現功能性LHRH受體(A) NIH:OVCAR-3， (B)不表達細胞表麵LHRH受體的SKOV-3卵巢癌細胞。EP-100在1小時內發揮其最大活性，而CLIP71則表現出較弱的殺傷細胞能力。LHRH受體陰性細胞(SKOV-3)對EP-100和CLIP71無反應。

這些數據表明EP-100和CLIP71通過不同的作用機製殺死細胞，受體靶向顯著增加了溶解肽的功效(圖7A和7B)。

總的來說，所有表達功能性LHRH受體的細胞係，如OVCAR-3，經EP-100處理後在0.5-1小時內表現出最大效果，而CLIP71需要24小時才能達到最大效果。不存在細胞表麵LHRH受體的細胞係(SKOV-3和HEK 1A;表2)，均耐EP-100。

在活的有機體內研究

之前在活的有機體內功效研究，劑量發現研究在裸鼠中進行。EP-100分別以2、5、16、25 mg/kg (N=4)的劑量靜脈注射，8 d後處死。注射劑量高達16毫克/公斤的EP-100的耐受性良好，存活率為100%。血液參數不變，與生理鹽水對照組相似(數據未顯示)。

卵巢癌異種移植

在腫瘤細胞注射後的第33天，以0.02 mg/kg (N=10)、0.2 mg/kg (N=10)和2.0 mg/kg (N=9)每周給藥兩次評估EP-100對人卵巢癌異種移植瘤(OVCAR-3)的療效。對照組接受生理鹽水注射，並在第33、34和35天腹腔注射非靶向CLIP71 (2mg/kg, N=10)或順鉑(N=10)，共10mg /kg。基線組在治療開始時犧牲(N=9)。

治療開始時(第33天)腫瘤體積為189.4±41 mm^3.．治療開始時腫瘤重量為0.152±0.021 g (N=9;基線組)。所有接受治療的小鼠和對照組都存活了下來。腫瘤體積(毫米^3.]，與生理鹽水對照組(1,147±326.9 mm)相似^3.(N=10)，對於CLIP71 1682±461 mm^3.(N=10)和1457±350 mm^3.(N=10)為順鉑治療小鼠。治療效果通過腫瘤體積與生理鹽水對照、CLIP71和順鉑的比較(圖8A和8B)、腫瘤重量與基線值的比較(圖8C)和腫瘤標誌物CA-125(圖8D)來衡量。

圖8:A和B) EP-100在耐藥卵巢癌異種移植瘤- ovcar -3中的療效。每周1次，連續3周，分別給予0.02、0.2或2mg /kg EP-100的異種移植小鼠腫瘤體積下降。C)與基線相比，所有EP-100治療組的腫瘤重量變化均有所下降，且在0.2 mg/kg EP-100和2 mg/kg EP-100治療組的腫瘤重量變化低於基線水平。D) EP-100治療組腫瘤標誌物CA-125顯著降低，證實腫瘤細胞死亡。E和F)生理鹽水對照組和EP-100治療小鼠的PET/CT掃描顯示治療後FDG攝取不足。

與生理鹽水對照組(1147±326.9 mm)相比，EP-100治療組腫瘤體積呈劑量依賴性減小^3.(N=10)， CLIP71(1682±461 mm)^3.(N=10)和順鉑(1457±350 mm)^3.(N=10)，最低劑量0.02 mg/kg時361.3±196 (p<0.025)顯著低於生理鹽水對照組，0.2 mg/kg時91.8±22.9 (p<0.0001)， 2 mg/kg時200.4±36 (p<0.001)。與生理鹽水對照組(0.3373±0.07 g)、CLIP71(0.3867±0.92 g)和順鉑(0.3825±0.07 g)相比，EP-100治療組研究終點腫瘤重量呈劑量依賴性下降，最低劑量0.02 mg/kg 0.174±0.052 (p<0.03)、0.2 mg/kg 0.089±0.023 (p<0.003)vs鹽水控製,p < 0.043vs2 mg/kg組為0.1188±0.034 g (p<0.042)。與CLIP71和順鉑相比，0.2 mg/kg的EP-100具有顯著性(p<0.03)。0.2和2mg /kg EP-100組均有2隻遊離小鼠(2/10和2/9)。

通過比較各組在基線和研究終點的腫瘤重量來確定腫瘤重量的變化。生理鹽水對照組、CLIP71組和順鉑組小鼠腫瘤重量分別增加0.1873±0.07 g、0.23±0.09 g和0.27±0.06 g。與基線相比，EP-100治療組在研究終點的腫瘤重量降低是劑量依賴性的，在0.2 mg/kg -0.06±0.02 g劑量下顯著降低(p<0.012)。與基線值相比，0.02 mg/kg劑量下腫瘤重量減少0.024±0.052 g, 2 mg/kg劑量下腫瘤重量減少-0.03±0.03 g(圖8C)。腫瘤重量在0.2和2 mg/kg劑量下的變化無顯著差異(p=0.24)，而0.02和0.2 mg/kg劑量之間的差異顯著(p<0.013)，表明在0.2 mg/kg劑量時達到最大療效。

腫瘤生長抑製(TGI)在0.2 mg/kg劑量下最大，分別為71.8、87.3和72.1%。這一觀察結果與其他異種移植模型一致，在0.2 mg/kg的EP-100注射中檢測到最大療效(未發表數據)。在先前的劑量反應研究中，在劑量低至0.02 mg/kg時，觀察到腫瘤體積縮小範圍為0.0002 ~ 2mg /kg。有趣的是，在接受測試的異種移植模型中，劑量大於0.2 mg/kg的增加通常不會轉化為療效的增加。在劑量達到1毫克/公斤時，所施劑量濃度低於0.25毫克/毫升，而在2毫克/公斤時，劑量濃度達到0.5毫克/毫升。劑量濃度大於0.5 mg/ml可能會影響注射部位尾靜脈的完整性，從而可能導致EP-100在這些高劑量下的輸送不足。這得到了未發表的異種移植模型數據的支持，其中，當以0.25 mg/ml的劑量濃度注射時，通過增加注射量，2 mg/ kg的劑量是有效的。

OVCAR-3異種移植腫瘤中的存活細胞分泌腫瘤標誌物CA-125，並作為EP-100、CLIP71和對照組(生理鹽水組和順鉑組)治療反應的衡量指標。血清CA-125水平與腫瘤重量相關(r²= 0.66)。腫瘤標誌物值CA- 125 [U/g腫瘤重量]與生理鹽水對照組相似，分別為2.99±1.13 U/g腫瘤重量(N=7)、2.7±1.4 U/g腫瘤重量(N=10)和2.4±0.6 U/g腫瘤重量(N=10)。在EP- 100治療組中，腫瘤標誌物CA-125值[U/g腫瘤重量]顯著降低，其中CA-125水平為0.8±0.4 (N=10)劑量0.02 mg/kg (p<0.016)， 0.2 mg/kg劑量0.02±0.02 (N=8) (p<0.008)， 2 mg/kg劑量0.49±0.23 (N=6) (p<0.034)(圖8D)。

在第二項研究中，在腫瘤細胞注射後的第38、41、44、48、52、59和61天，對OVCAR-3異種移植小鼠進行了每周兩次的EP-100注射，劑量為0.2 mg/kg，共6次。與生理鹽水對照組(0.52±0.9 g)相比，EP-100處理小鼠的腫瘤重量(0.22±0.03 g)降低(p<0.0004)。EP-100治療組在第50天有3/16個腫瘤出現充滿液體的囊腫，第59天有4/16個腫瘤再次出現充滿液體的囊腫。

［¹⁸F]-2-氟-2-脫氧-d -葡萄糖(FDG)是一種在高代謝活性細胞中積累的造影劑，在臨床上用於存活腫瘤的測定和診斷。在生理鹽水對照和EP-100治療的可觸及腫瘤小鼠的PET/CT掃描中觀察到治療反應的進一步證據。沒有(¹⁸F]在EP-100處理的動物中檢測到-DG的攝取，而生理鹽水對照組顯示[¹⁸F]-DG攝取(圖8E和8F)證實腫瘤在EP-100治療後無法存活。

用治療小鼠的蘇木精/伊紅染色的腫瘤切片的組織學評價顯示，在生理鹽水對照組、CLIP71和順鉑治療的小鼠中，腫瘤細胞存活。在經生理鹽水或未結合的CLIP71處理的腫瘤中發現有絲分裂圖的存活腫瘤細胞(圖9A和9B)。EP-100處理的小鼠腫瘤切片未見存活的腫瘤細胞。在所有劑量EP-100治療的小鼠腫瘤中明顯出現廣泛壞死和免疫細胞浸潤，以0.2和2mg /kg劑量最常見(圖9C和9D)。

圖9:生理鹽水對照組、CLIP71組和EP-100組腫瘤組織學變化。生理鹽水對照組和CLIP71組腫瘤細胞存活，有絲分裂圖多。EP-100處理的腫瘤壞死，巨噬細胞浸潤。

總之，EP-100在異種移植小鼠中具有良好的耐受性，並可導致腫瘤消退和腫瘤壞死，以0.2 mg/kg劑量單周注射或6周後以0.2 mg/kg劑量兩周注射。根據腫瘤標誌物測量和PET/CT掃描分析，EP-100治療小鼠的腫瘤不存活。CLIP71在全身給藥時對異種移植瘤無殺傷作用。EP-100在所有研究中均未影響CBC或血清化學。

討論

EP-100是一種新型、靶向、膜破壞肽，是從300多種新設計的具有高抗癌活性和低溶血活性的溶肽綴合物中篩選出的。EP-100是一個28個氨基酸的肽(MW=3,317 g/mol)，由黃體生成素釋放激素的天然激素序列和一個18個氨基酸的溶解肽(稱為CLIP71)組成。EP-100的序列可以很容易地通過標準固相化學放大合成，並生產了高達500克的數量用於臨床試驗。本文介紹了IND提交的1期和2期臨床研究之前的EP-100的臨床前數據集。部分數據已在國際會議上以海報形式展示。部分數據是IND提交後生成的，並在本文中展示。

EP-100被設計用來靶向並專門殺死過度表達LHRH受體的癌細胞通過一種涉及直接膜破壞和壞死的新作用機製。LHRH和CLIP71在沒有連接子的情況下連接在一起形成癌細胞靶向溶肽。有毒部分的釋放對抗癌活性並不必需。由於EP-100在癌症治療方麵具有廣泛的應用潛力，因此被選為臨床應用的開發對象。在本文中，我們證明了1)EP-100與LHRH受體的高親和力結合，2)細胞殺傷與靶癌細胞表麵LHRH受體的表達相關，3)細胞殺傷發生在LHRH受體陽性癌細胞株的1-4小時內，4)作用機製涉及線粒體的快速膜裂解而不去極化，5)癌細胞因壞死而死亡，6)與未偶聯的溶肽不同，EP-100係統給藥卵巢癌異種移植小鼠具有強效作用，通過壞死殺死異種移植卵巢腫瘤並誘導免疫細胞浸潤。

人們希望增加癌症治療的特異性，以提高係統給藥藥物的療效和安全性。選擇性靶向外周組織未表達的癌細胞表麵受體[11,12]，確保特異性，減少脫靶效應和重要器官的損傷。LHRH受體在許多實體瘤和血液惡性腫瘤中過表達，但在除性腺和垂體外的重要器官組織中不表達。它能迅速內化和回收，並通過受體介導的攝取高效地積累化合物[61,62]。各種LHRH毒素結合物已經合成，並顯示出令人鼓舞的臨床前活性和生物相容性，基於毒素的特異性傳遞到目標細胞。然而，這些結合物需要高度特異性的連接子技術，以確保結合物在循環中的穩定性，並促進毒素在靶細胞內的釋放。這對於像美洲商陸蛋白[14]和假單胞菌外毒素[15]，阿黴素[8]，紫杉醇[17]，喜樹堿[11]。盡管增加了特異性，但這些結合毒素一旦進入循環係統就會引起全身毒性和副作用。所有這些結合物都處於臨床前階段，除了lhrh -阿黴素結合物，該結合物已開發用於臨床應用，目前正在子宮內膜癌患者中進行III期臨床研究[10]。

溶肽綴合物代表了一類新的癌症療法:它們通過細胞膜破壞迅速起作用，可能不依賴於耐藥性和癌細胞增殖。LHRH給出了新設計的溶肽綴合物EP-100的靶向部分。通過靶向並結合細胞表麵的LHRH受體，EP-100特異性積累在靶細胞上，促進了裂解肽膜的相互作用，而無需切割連接子釋放毒素。這種相互作用導致細胞膜破裂，導致細胞快速死亡。EP-100的快速作用模式導致細胞在幾分鍾內死亡，這是由於與靶細胞膜快速、直接的相互作用，與未結合CLIP71相比，EP-100的動力學證明了這一點。一般來說,在體外接觸LHRH受體陽性癌細胞株幾分鍾內獲得的共軛溶解肽EP- 100的毒性介於0.5到5微摩爾之間在體外．第一個人體臨床試驗的藥代動力學研究表明，患者體內EP-100的微量摩爾水平達到17.6 mg/m²超過1小時[56]。

靶向溶肽EP-100的抗癌活性優於未結合的溶肽，從細胞殺傷動力學上看，早在4小時就有最大效果。殺死癌細胞的EP-100的半最大濃度比CLIP-71低28倍。此外，不表達LHRH受體的癌細胞在較高的IC下被EP-100和CLIP71殺死的效果相同₅₀24小時後的值。EP-100的活性與細胞表麵LHRH受體表達水平相關，但與LHRH受體mRNA表達水平無關。非癌細胞株對EP-100或CLIP71具有耐藥性，EP-100和CLIP71的效力都比癌細胞弱50倍。這些結果與Johnstone[63]和Camilio[27]的發現相似。最重要的是，EP-100在連續6個月的時間裏，每周兩次反複輸注給患者，不會對重要器官造成不良影響。

裂解肽單元CLIP71的效力與文獻中描述的其他合成的非靶向裂解肽相當在體外IC的多種癌細胞係₅₀數值範圍為2.9- 14微摩爾[27,28,64]。然而，用於臨床開發的非結合溶肽的一個主要缺點是不能全身給藥，從而限製了其臨床應用直接注射到腫瘤中[27,30]。這與EP-100和其他靶向溶肽形成鮮明對比，這些肽可以全身注射，適用於原發性腫瘤和轉移瘤的治療。與天然溶肽melittin和合成肽LL37不同，EP-100不具有溶血性和抗原性，適合臨床應用。EP-100的細胞殺傷機製之一與低微摩爾水平的質膜崩解有關，沒有線粒體去極化的證據。裂解肽殺死細胞的機製包括膜活性裂解，如果內化，則包括線粒體毒性[65-67]。Gaspar等人綜述了顯示出膜活性和或內化[23]的溶解肽的各種序列和組成。這兩種機製均被確認為壞死，繼發於質膜破壞[67]。乳鐵蛋白類似物LTX-315在高濃度(35µM)時出現膜崩解，在低濃度(3.5µM)時內化，觀察到線粒體膜去極化[68]。一些裂解肽會產生凋亡，特別是當肽發生內化時[69]。 In these cases mitochondrial membrane permeabilization occurred or change of mitochondrial membrane potential [39,70,71]. Two 23 amino acid lytic peptide conjugates targeting LHRH receptors were described by Yates et al., demonstrating cell killing activity of 5-6 and 9-10 µM within 6 hours in prostate cancer cell lines that expressed LHRH receptors. Interestingly these two lytic peptide conjugates exerted different mechanism of action: JCHLHRH (KLA composition) caused membrane rupture and cell bursting; whereas cells exposed to JC21LHRH (KFA composition) showed cell shrinkage without bursting and expression of the apoptotic marker Annexin V [35].在活的有機體內數據沒有提出這個水解肽共軛。

雖然EP-100的具體作用機製尚未確定，但與正常細胞相比，癌細胞細胞膜的崩解可能與其表麵膜的特性有關。溶解肽的正電荷為其高效破壞帶負電荷的膜(如癌細胞膜)奠定了基礎。

真核細胞的表麵膜具有脂質的不對稱分布，這決定了其表麵電荷[72,73]。癌細胞是帶負電荷的，因為它們的外膜含有高達8倍的帶負電荷的膜脂磷脂酰絲氨酸(PS)，而正常細胞的外膜是中性的，隻在內質膜中含有PS[73-76]。這種電荷分布導致癌細胞膜對陽離子細胞溶解肽更敏感。正常細胞具有中性細胞膜，不促進與陽離子肽部分的相互作用，它們的膜膽固醇阻止肽插入，導致細胞溶解肽的早期蛋白水解破壞[77,78]。癌細胞表麵的硫酸肝素的存在可能會由於負電荷的中和作用而影響溶肽與膜的相互作用[79]。目前還沒有數據來確定EP-100和類似的溶肽偶聯物是否也是如此。

快速的細胞毒性是通過水解肽與細胞膜的直接相互作用產生的(綜述見[20,21]。這是通過將配體偶聯到細胞溶解肽上來實現的，以增加對目標細胞的特異性，並通過破壞細胞膜所需的受體-配體結合促進濃度和積累在細胞膜上。綜上所述，通過在癌細胞表麵表達LHRH受體，以及通過PS積累在癌細胞細胞膜上的高負電荷，促進了EP-100殺傷癌細胞而非殺傷正常細胞的快速細胞殺傷特性和特異性。此外，正常細胞中的膽固醇含量可以防止溶解肽的攻擊，即使是表達LHRH受體的正常細胞，如垂體和性腺。表達LHRH受體的垂體細胞釋放LH和FSH。EP-100對垂體的藥效學作用已被觀察到，並導致在EP-100治療患者時LH和FSH的釋放減少。停止EP-100治療[56]後，LH和FSH生產恢複。

在在活的有機體內研究表明，EP-100在全身給藥時具有高度活性。EP-100表現出有效和特異性的細胞殺傷作用，使腫瘤體積和腫瘤重量減少，活腫瘤細胞減少，並在治療組的腫瘤切片中檢測到壞死證據。EP-100治療的腫瘤有明顯的免疫細胞浸潤。相比之下，非共軛溶解肽CLIP71或LHRH肽沒有活性在活的有機體內當係統注入。CLIP71對腫瘤組織學和腫瘤負荷無影響。EP-100在人卵巢癌異種移植瘤中表現出優異的活性在活的有機體內每周給藥一次，持續3周(劑量低至0.02 mg/kg)。經組織學、PET/CT和腫瘤標誌物CA- 125的測定證實，在4周的時間內6次以0.2 mg/kg的劑量注射EP-100後，小鼠無腫瘤，腫瘤活力下降。與第一代靶向溶肽結合物Hecate-LHRH和Phor21-LHRH相比，EP-100更優:EP-100在移植瘤模型中劑量較低(0.02 mg/kg，而在前列腺癌移植瘤模型中為12 mg/kg，在胰腺癌移植瘤模型中為10 mg/kg)[41-49,77]。第一代溶肽偶聯物Hecate-LHRH(<10µM)和Phor21-LHRH(21µM)比EP-100(>300µM)更具溶血性，不太適合臨床開發[作者未發表數據]。EP-100在小鼠中具有良好的耐受性，即使重複注射劑量高達卵巢癌異種移植瘤有效治療劑量(0.02 mg/kg)的400倍(8 mg/kg)。大體病理和血清化學結果顯示，治療小鼠未見肝或腎毒性，治療小鼠體重保持穩定，表明EP-100在異種移植模型中具有高特異性。對卵巢癌移植裸鼠的有效劑量低至0.02 mg/kg，是含結合物[33]的Phor21的10倍。EP-100在裸鼠中達到25 mg/kg的劑量極限毒性，在CD1小鼠中重複劑量研究達到8 mg/kg。根據人類1期臨床試驗之前進行的毒理學數據，EP-100全身給藥的治療窗口至少是40倍。

CLIP71的其他共軛物表現出與EP-100相似的性質。CLIP-71結合FSH靶向前列腺癌異種移植瘤上的FSH受體表明，0.2 mg/kg的低劑量可有效通過壞死殺死癌細胞，並減少表達靶受體的新生血管[80]。

一些溶解肽結合物處於臨床前階段:含有D氨基酸序列的14個氨基酸的溶解肽(KLAKLAK)₂與PSMA[36]、抗cd33、抗cd19[37]、腫瘤和新生血管靶向肽RGD[38]、her2靶向肽[40]和胃泌素靶向肽共軛[39]等配體結合，這些配體在體外低微摩爾範圍內表現出特異性，並在異種移植模型中靜脈注射劑量為3mg /kg後顯示腫瘤生長停止。合成的溶解肽(D-K₆l₉)偶聯到EGFR靶向肽顯示了在濃度在6.5- 12 μ M之間殺死各種人類癌細胞係的特異性，而非靶向溶解肽16-32 μ M[34]。細胞在1小時內迅速死亡。對其作用機製的評估表明，EGF-D-K₆l₉通過凋亡殺死靶細胞。全身靜脈注射EGF-D-K₆l₉以2、5和10 mg/kg[34]劑量在3周內殺死異種移植的乳腺癌和胰腺癌細胞。與上述總結的例子相比，EP-100是一種在體外低摩爾水平下殺死癌細胞的更有效的化合物。如各種含亮氨酸的裂解肽所示，由苯丙氨酸組成的裂解肽會導致壞死而不是凋亡[34-36]。

結論

綜上所述，EP-100, CLIP71在沒有連接子的情況下與LHRH結合，是一種高選擇性的強效肽結合物。EP-100與LHRH受體具有高親和力，具有廣泛的治療餘地，具有快速作用的分子，不具有抗原性，並能快速殺死在人體中可達到的低微摩爾水平的LHRH受體表達癌細胞。EP- 100的快速作用是以細胞膜的分解為基礎的。EP-100不含任何鏈接劑，不需要釋放溶解肽結構域就能發揮細胞殺傷作用，不像結合到LHRH上的小分子需要通過鏈接劑裂解內化和細胞內釋放毒素。在活的有機體內研究表明，細胞通過壞死殺死，導致腫瘤體積和重量減少以及免疫細胞浸潤。由於EP-100具有良好的安全性及其殺死LHRH受體陽性癌症的高效力，EP-100可能在卵巢癌包括多藥耐藥癌症的臨床應用中具有潛力。在76例患者中使用EP-100進行了長達18個月的兩項臨床試驗，獲得了安全性數據，證明在晚期卵巢癌患者中，EP-100作為單一藥物(NCT0094955)或與紫杉醇聯合使用(NCT01485848)缺乏免疫原性，沒有器官毒性和骨髓抑製。

選擇卵巢癌作為第一種臨床指征的決定是基於對晚期、多藥耐藥卵巢癌患者的需求高度未滿足，這些患者的腫瘤對化療沒有反應，且有明確的審批途徑。卵巢癌中LHRH受體的表達高達80%，EP-100為這一患者群體提供了一個有效的候選對象。

EP-100使用一種新的作用機製殺死LHRH受體陽性癌症的特異性，為擴大臨床適應症到乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宮內膜癌以及黑色素瘤和血液係統惡性腫瘤提供了機會。

確認

作者們感謝Deborah Vollmer Dahlke博士幫助準備手稿。我們感謝巴巴頓魯日市核醫學OLOL、PET、SPECT和CT成像主任Steve Bujenovic博士和路易斯安那州立大學巴巴頓魯日市物理與天文係Kenneth (Kip) Matthews二世博士為PET成像和分析提供了方便。

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