熊Y1、2、3羅素DL1、2麥當勞LT1、2科沃特拉1、4們交流1、2、3 *
1研究服務，拉爾夫·H·約翰遜退伍軍人事務醫療中心，查爾斯頓，南卡羅來納州，美國*通訊作者:LaRue AC，美國南卡羅來納州查爾斯頓，南卡醫科大學霍林斯癌症中心，電話:+ 1-843-789-6707;傳真:+ 1-843-876-5381;電子郵件:laruerc@musc.edu
文章類型:研究文章
引用:熊毅，Russell DL, McDonald LT, Cowart LA, LaRue AC(2017)造血幹細胞來源的脂肪細胞促進腫瘤生長和癌細胞遷移。國際癌症研究分子力學3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.130
版權:©2017熊勇，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。
出版的曆史:
脂肪細胞除了作為能量存儲庫的關鍵作用外，還有助於腫瘤微環境的組成。我們之前的研究基於單一造血幹細胞移植模型，揭示了一種新的脂肪細胞來源通過單核細胞/巨噬細胞祖細胞。在此，我們擴展了這些研究，以檢查造血幹細胞來源的脂肪細胞(HSC-Ad)在腫瘤進展中的作用。當在成脂條件下培養時，骨髓來源的單核細胞祖細胞分化為脂肪細胞，積累含有甘油三酯的油滴。脂肪因子陣列和elisa證實了HSC-Ad分泌多種脂肪因子。這些脂肪細胞進一步發育在活的有機體內皮下注射到C57Bl/6小鼠。當HSC-Ad與黑素瘤B16F1細胞或乳腺癌E0771細胞共同注射到同基因C57Bl/6小鼠中時，HSC-Ad不僅加速了黑素瘤和乳腺腫瘤的生長，而且還增強了這兩種腫瘤的血管化。來自HSC-Ad的條件培養基支持B16F1和E0771細胞增殖和增強細胞遷移在體外．在HSC-Ad分泌的脂肪因子中，胰島素樣生長因子1 (IGF-1)在E0771細胞增殖中起重要作用。肝細胞生長因子(HGF)是B16F1細胞遷移必不可少的，而HGF和血小板衍生生長因子BB (PDGF-BB)共同促進E0771細胞遷移。IGF-1、HGF和PDGF-BB受體的表達水平與其在B16F1和E0771細胞增殖和遷移中的不同作用相關。我們的數據表明HSC-Ad通過不同的機製調節腫瘤行為。
造血幹細胞;脂肪細胞;黑色素瘤;乳腺癌;腫瘤微環境
腫瘤細胞隻有在複雜的組織環境為其提供允許和支持的環境時才能生長。因此，腫瘤的增殖、侵襲性、血管生成和轉移潛能依賴於腫瘤細胞和腫瘤微環境細胞之間複雜的雙向串擾。構成腫瘤間質的細胞包括成纖維細胞和脂肪細胞，招募的免疫細胞，以及新形成血管中的內皮細胞[1]。脂肪細胞存在於多種組織中，其中一些組織具有富含脂肪細胞的環境，如乳腺和骨髓。迄今為止，大多數關注癌細胞-基質細胞通訊的研究都強調成纖維細胞、內皮細胞和炎症細胞的貢獻，而脂肪細胞在腫瘤進展中的作用則需要更深入的探索。
新出現的證據表明，脂肪細胞除了作為最大的能量儲存庫的關鍵作用外，還是內分泌細胞，產生激素、生長因子、趨化因子和脂肪因子，這些因子影響各種癌症類型[2]中的腫瘤生長、轉移和耐藥。例如，脂肪細胞在乳腺癌生長和轉移中的作用已被廣泛研究[3-5]。最近，脂肪細胞已被證明能以遊離脂肪酸的形式向鄰近的癌細胞提供脂質，以供它們產生能量[6,7]。在與癌細胞相互作用過程中，脂肪細胞發生表型改變(如去脂化、去分化)和功能改變(如白細胞介素-6的產生增加)，因此被稱為癌症相關脂肪細胞[8,9]。已有研究表明，癌症相關脂肪細胞可向癌細胞提供高水平的促炎細胞因子[4]、蛋白酶[10,11]和細胞外基質成分[12,13]，從而加速腫瘤進展。
從祖細胞中生成新的脂肪細胞對於理解正常或病理條件下的脂肪組織發育和周轉(如肥胖和癌症)具有很大的興趣。脂肪細胞通常被認為來源於脂肪組織的前脂肪細胞和間充質幹細胞(mesenchymstem cells, MSCs)[14,15]。包括我們實驗室在內的幾個研究小組發現了一種源於骨髓來源的循環祖細胞的新型脂肪細胞群[16-18]。骨髓為骨髓間充質幹細胞和造血幹細胞提供了豐富的來源。在我們的實驗室中，移植來自單一egfp陽性HSC的克隆細胞群，證明了分化的脂肪細胞的HSC起源通過單核/巨噬細胞祖細胞[18]。這得到了Klemm小組的工作的支持，他們使用了非移植轉基因小鼠模型，其中LacZ的表達僅限於骨髓係，證實了這一觀點新創從骨髓造血/髓係祖細胞[19]中產生脂肪細胞亞群。
為了更好地了解造血幹細胞來源的脂肪細胞(HSCAd)在腫瘤進展中的作用，我們富集了骨髓來源的單核細胞祖細胞，並將其分化為脂肪細胞。我們進一步分析了它們對腫瘤行為的影響，特別是對腫瘤生長和癌細胞運動的影響。在本研究中，我們證明HSC-Ad分泌的生長因子和脂肪因子對黑色素瘤和乳腺腫瘤的生長和癌細胞遷移有不同的調節作用。我們已經證明，這些影響依賴於腫瘤模型中不同信號通路的參與。
C57Bl/6-CD45.1育種機購自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME)。轉基因EGFP育種對(C57Bl/6-CD45.2背景)由Masaru Okabe博士[20](日本大阪大學)提供。老鼠是在退伍軍人事務醫療中心(查爾斯頓，南卡羅來納州)的動物研究設施培育和飼養的。研究是根據PHS關於人類護理和實驗動物使用的政策以及退伍軍人事務部醫療中心機構動物護理和使用委員會製定的指導方針進行的。
小鼠黑素瘤細胞係B16F1購自美國類型培養收藏館(ATCC, Manassas, VA)，小鼠乳腺癌細胞係E0771是Dennis Watson博士(MUSC, Charleston, SC)的禮物。在這項研究中，兩種細胞係都維持在37°C、5% CO的潮濕氣氛中的低傳代(<10)中2．B16F1細胞在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco 's Modified Eagle培養基(DMEM)中培養。E0771細胞在含20%胎牛血清的DMEM中培養。
細胞培養基購買自Life Technologies (Grand Island, NY)。FBS來自亞特蘭大生物公司(佐治亞州弗勞爾裏分公司)。重組蛋白和中和抗體購自研發係統(明尼蘇達州明尼阿波利斯市)。藻紅蛋白(PE)偶聯的抗f4 /80 (T45-2342)和異藻藍蛋白(APC)偶聯的抗d11b (M1/70)抗體來自BD生物科學公司(San Jose, California)。pe偶聯抗c- met (eBioclone 7)抗體來自eBioscience (San Diego, California)。CD31抗體來自Abcam (Cambridge, Massachusetts)。用於western blot的抗體購自Cell Signaling Technology (Danvers, Massachusetts)。抑製劑購自Selleckchem (Houston, Texas)。
如Stanley及其同事[21]所述，原始單個核前體細胞生成並擴增。簡單地說，提取小鼠骨髓細胞，並在含有20%胎牛血清、15 ng/mL白細胞介素-3 (IL-3)和0.6 ng/mL巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)的最低必需培養基α (α mem)中培養3天。用0.02% Pronase (EMD Millipore)處理非貼壁細胞，然後在含有20% FBS和10 ng/ mL M-CSF的αMEM中培養2天。將得到的貼壁細胞補充100 ng/mL的M-CSF 3天，使其分化為巨噬細胞，或將其置於如下所述的成脂條件下。
為了使貼壁細胞分化為脂肪細胞，將完全生長培養基替換為由αMEM、10%胎牛血清、10%小鼠血清(MS)、100 ng/mL M- csf、0.5 mM異丁基甲基黃嘌呤、1µM地塞米鬆和10µg/mL胰島素組成的成脂起始培養基。培養2天後，將培養基替換為含αMEM、10% FBS、10% MS、100 ng/mL M-CSF和10µg/mL胰島素的脂肪形成進展培養基。兩天後，將培養基換成含有αMEM、10% FBS、10% MS和100 ng/mL M-CSF的脂肪形成維持培養基，繼續孵育至少5天。對於脂肪細胞條件培養基(Ad-CM)，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)衝洗細胞兩次，隨後加入αMEM。24 h後收集培養基，2000轉/分離心5 min，上清定量分泌脂肪因子，測定對腫瘤細胞增殖和遷移的影響。
皮下脂肪組織被切除並在含有1 mg/mL I型膠原酶(Sigma, St. Louis, Missouri)和0.1%牛血清白蛋白(BSA)的DMEM/F12培養基中切碎，並在37°C的旋轉攪拌器上以100轉/分的速度孵育1小時。未消化的組織通過150微米的網狀過濾器過濾後被去除。然後通過200 g離心5分鍾從間質血管細胞中分離成熟脂肪細胞。收集成熟脂肪細胞(頂層)並進行天花板培養[22]。
用5% NP-40從細胞中提取甘油三酯，並根據製造商的協議使用甘油三酯測定試劑盒(Abcam)進行量化。使用單獨的Quantikine ELISA試劑盒(R&D係統)定量Ad-CM中分泌的脂肪因子。使用運行Soft Max Pro軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)的SPECTRAmax M2微孔板閱讀器分析數據。
B16f1 (2 × 105)細胞用無血清培養基洗滌，加或不加HSC-Ad重懸(8 × 105)加入200µL Matrigel (Corning, Tewksbury, Massachusetts)，並皮下注射到C57Bl/6-CD45.1小鼠。(2 × 105)細胞用無血清培養基洗滌，加或不加HSC-Ad重懸(8 × 105)加入50µL的Matrigel，注射到C57Bl/6-CD45.1雌性小鼠的第4乳腺。在腫瘤生長過程中測量腫瘤麵積(長×寬)，在安樂死結束時測量腫瘤體積(0.5 ×長×寬×高)。在原位模型中，研究了不同的腫瘤與間質比例:1:1與1:4。我們觀察到B16F1/E0771: HSC-Ad比例1:1在所研究的時間段內對加速腫瘤生長沒有顯著作用，因此使用腫瘤與基質的比例為1:4在活的有機體內實驗。
腫瘤切片(5µM)在二甲苯中脫蠟，並按照標準程序在酒精中脫水。用兔IgG試劑盒(Vector實驗室)對切片進行CD31抗體染色，並用蘇木精反染色。每組3個腫瘤切片在尼康Eclipse 90i顯微鏡上成像。每節3-4個高功率場(HPF, 200X)定量測量血管數量和管腔麵積。
在細胞增殖實驗中，腫瘤細胞以3 × 10的密度接種，每3個重複3.根據製造商的協議，使用CyQUANT NF細胞增殖檢測試劑盒(Life Technologies)在3天內定量96孔板中每孔的細胞。遷移實驗使用孔徑為8.0µm的Costar Transwell嵌件(Corning)進行，嵌件上塗有人纖維連接蛋白。B16f1 (3 × 104)或E0771 (5 × 104)細胞重懸於100 μ L無血清培養基中，並在纖維連接蛋白包被的插入膜上播種。實驗介質被放置在插入物下方的井中。在5% CO中孵育4小時2在37°C，用棉簽去除未遷移的細胞，將遷移到膜另一側的細胞固定並使用Diff-Quick試劑盒(Siemens Healthcare Diagnostics, Malvern, PA)進行染色。細胞數從每個插入的10個HPFs計算和平均。
用apc偶聯的抗cd11b和pe偶聯的抗f4 /80抗體對骨髓來源的單核細胞進行染色。用pe偶聯抗c- met抗體對腫瘤細胞進行染色。使用FACSCalibur (Becton Dickinson)分析碘化丙啶(PI)陰性活細胞。
細胞在裂解液中收集，裂解液由50 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、1% NP-40和5 mM EDTA組成。在4°C裂解緩衝液中孵育30分鍾後，在4°C下以13000 rpm離心10分鍾清除裂解物。收集上清液，使用BCA蛋白測定試劑盒(賽默飛世爾科學公司)測定蛋白濃度。總蛋白(40µg)加載並在SDS-PAGE凝膠上運行，轉移到PVDF膜上，在5%牛奶中封閉，在ECL (Bio-Rad)孵育和膜曝光前用適當的抗體和酶標二抗進行印跡。
使用Excel進行統計分析。為在體外實驗中，所有數據均以均數±標準差表示。均數(至少3個獨立實驗)之間差異的統計學意義用雙尾Student 's進行評估t測試。*p≤0.05，**p<0.01， ***p<0.001被認為是顯著值，而“n.s。表示不重要。
通過移植[18]和非移植[19]小鼠模型，我們和其他人已經證明造血幹細胞(hsc)能夠分化成脂肪細胞通過單核/巨噬細胞的祖細胞。為了進一步擴展這一初步觀察，根據Stanley等人[21]建立的方法，從骨髓中生成並擴增原始單核細胞祖細胞，並在材料和方法中進行描述(圖1A)。作為概念的證明，在10 ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)中培養2天後，非貼壁細胞變成貼壁細胞並為CD11b高F4/80——/暗(圖1a -中間麵板)在100 ng/mL的M-CSF中再培養3天，貼壁細胞表現出高水平的F4/80表達(圖1a右側麵板)以及細長的形態(圖1b頂部麵板)，兩者都表明細胞分化為成熟的骨髓來源的巨噬細胞(BM-MΦ)。然而，在成脂條件下，這些hsc來源的細胞Oil Red O (ORO)染色呈陽性(圖1b -底板)，並積累了多個含有甘油三酯的脂滴(圖1C)。BM-MΦ細胞為oro陰性(圖1b -頂麵板)，不儲存任何甘油三酯(圖1C)。hsc衍生的脂肪細胞(HSC-Ad)也分泌脂肪因子，包括脂聯素、胰島素樣生長因子-1 (IGF-1)、單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)和血管內皮生長因子(VEGF)(圖1D，補充圖S1)。盡管脂肪因子陣列(Adipokine Array)幾乎檢測不到肝細胞生長因子(HGF)(圖1D)，但HGF的存在被ELISA證實(補充圖S1)。這些結果表明，單核細胞祖細胞能夠分化為脂肪細胞在體外．
圖1:單核細胞前體在體外和體內都能產生脂肪細胞——(A)在白細胞介素-3 (IL-3)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)存在的情況下，骨髓單核細胞前體富集。CD11b和F4/80染色的FACS分析表明巨噬細胞從單核細胞前體分化。(B)骨髓來源的巨噬細胞(BM-MΦ)和通過單核細胞前體(HSC- ad)從造血幹細胞(HSC)分化而來的脂肪細胞，用油紅O (ORO)染色並用相對比成像顯示。(C)從BM-MΦ和HSC-Ad中提取甘油三酯含量，並進行量化。NA，未檢測到。(D)將BM-MΦ或HSC-Ad餓死過夜，所得培養基作為條件培養基，記為MΦ-CM或Ad-CM。將MΦ-CM和Ad-CM置於Adipokine陣列(R&D係統)中，並比較分泌的脂肪因子的分布。(E)將EGFP+ HSC-Ad嵌入Matrigel並皮下注射到C57Bl/6小鼠體內。3周後，提取成熟脂肪細胞，培養並成像。箭頭表示胚胎幹細胞來源的成熟EGFP+脂肪細胞。 Scale bars=25 µm.
為了確定HSC-Ad是否能夠進一步成熟並在其細胞質中形成一個大的中心脂肪液滴，我們從EGFP小鼠骨髓中產生單核細胞祖細胞，並將其分化為脂肪細胞在體外．這些egfp陽性脂肪細胞被植入Matrigel，混合物被皮下注射到C57Bl/6小鼠體內。植入後3周從植入部位脂肪組織中提取成熟脂肪細胞，吊頂培養[22]。2天後，分離的脂肪細胞鬆散地粘附在天花板表麵，隨後進行培養成像。一些單眼形態的成熟脂肪細胞(圖1e上麵板)EGFP熒光呈陽性(圖1e下麵板)，提示在良好的微環境下，HSC-Ad能夠充分發育並融入脂肪組織。
HSC-Ad對腫瘤生長的影響在活的有機體內接著被檢查。在這項研究中使用了兩種類型的小鼠腫瘤細胞係，黑色素瘤細胞係B16F1和乳腺癌細胞係E0771。原位注射腫瘤細胞(皮下- B16F1;乳腺脂肪板- e0771)單獨或與HSC-Ad以1:4的比例轉染同基因C57Bl/6小鼠。B16F1允許腫瘤進展到第14天，E0771允許腫瘤進展到第32天，這是由於IACUC批準的人道終點，腫瘤直徑不能超過2厘米。
在黑色素瘤模型中，每天測量腫瘤大小，並在第14天對小鼠實施安樂死。單獨注射時，B16F1腫瘤在第10天可測量(圖2A)。在共注射HSC-Ad時，B16F1腫瘤在第8天可測量(圖2A)。此外，在終點處，HSC-Ad聯合注射導致黑色素瘤更大(2.7倍，p<0.01)(圖2B)和更重(2.7倍，p<0.01)(圖2C)。HSC-Ad不僅促進了B16F1腫瘤的發生，而且加速了B16F1腫瘤的生長速度，B16F1腫瘤的生長速度從43.85±13.17 mm顯著升高(p<0.01)2單獨注射時，可達69.53±8.44 mm2共注射HSC-Ad時(圖2A)。
關於乳房腫瘤生長，每周測量兩次腫瘤大小，並在第32天根據批準的人道終點對小鼠實施安樂死。單獨注射E0771在第10天形成了可測量的腫瘤，聯合注射E0771- hsc - ad也是如此(圖2D)。與B16F1腫瘤不同，共注射HSC-Ad沒有影響E0771腫瘤的起始，然而，HSC-Ad顯示出E0771腫瘤加速生長的趨勢，導致終點處乳腺腫瘤顯著增大(1.9倍，p<0.05)(圖2E)和加重(1.8倍，p<0.05)(圖2F)。單獨注射HSC-Ad在兩種模型中均未產生腫瘤(圖2A和2D)。
圖2:造血幹細胞來源的脂肪細胞在體內加速黑色素瘤(B16F1)和乳腺腫瘤(E0771)的生長
)、HSC-Ad (
)，或兩者兼備(
)和if701原位注射C57Bl/6小鼠。定期測量腫瘤麵積(a, D)。在安樂死結束時，測量腫瘤體積(B, E)和質量(C, F)。(A-C) B16F1腫瘤生長。(D-F) E0771腫瘤生長。*p≤0.05，**p<0.01， ***p<0.001。
一個重要的促腫瘤過程是血管生成，其作用是加強腫瘤的氧氣和營養供應。我們觀察到HSCAd分泌促血管生成因子VEGF(圖1D)，這使我們研究了HSC-Ad對黑色素瘤和乳腺腫瘤血管化的影響。使用CD31(內皮細胞標記物)抗體對腫瘤石蠟切片(5µm)進行染色(圖3A)。測量血管數量和腔麵積。定量分析顯示，在兩種腫瘤模型中，無論是否同時注射HSCAd，血管數量均保持不變(圖3B)。然而，與單獨注射腫瘤細胞相比，聯合注射HSC-Ad可形成管腔麵積顯著增大的血管(黑色素瘤增加約5倍，p<0.001;在兩種腫瘤模型中，乳腺癌增加4.4倍，p<0.001)(圖3C)。HSC-Ad似乎對黑素瘤血管體積的擴大有更大的影響，這與B16F1腫瘤生長比E0771腫瘤生長對HSC-Ad共注射更敏感一致。這些結果表明HSC-Ad促進腫瘤生長，至少在一定程度上是通過血管腔麵積增大來促進腫瘤血管化。
圖3:造血幹細胞來源的脂肪細胞增強B16F1和E0771腫瘤的血管化在活的有機體內-將腫瘤細胞單獨或聯合HSC-Ad原位注射到C57Bl/6小鼠體內。(A)腫瘤切片(5 μm)用CD31抗體染色顯示血管，血毒素反染色。(B)血管數量(#)的量化。(C)測量血管腔麵積，並以共注射與僅注射腫瘤細胞的倍數變化表示。每組3個腫瘤的3-4個高功率場(HPF, 200X)數據取平均值(n=3)。* * * p < 0.001。n.s.，不重要。
HSC-Ad在腫瘤生長中的促血管生成作用在活的有機體內，我們接下來研究了它們對腫瘤細胞增殖的影響在體外．將HSC-Ad餓死過夜，所得培養基用作條件培養基(Ad-CM)。B16F1或E0771細胞在AdCM中培養3天，每天定量細胞數量。與維持在無血清αMEM中的細胞相比，B16F1(圖4A)和E0771(圖4B)細胞對Ad-CM的反應數量都有所增加。值得注意的是，Ad-CM存在時B16F1細胞的增殖率高於E0771細胞(倍增時間30.24±3.96 h)vs41.75±1.71 h, p<0.05)。這與我們發現共注射HSC-Ad加速B16F1腫瘤生長比加速E0771腫瘤生長更有效相一致。
圖4:體外造血幹細胞來源的脂肪細胞通過激活的ERK和AKT通路支持B16F1和E0771細胞的增殖-(A) B16F1和(B) E0771細胞培養於無血清αMEM ()或Ad-CM ()持續3天，細胞數(#)每日量化，並從多次實驗中取平均值。*p< 0.05， ***p<0.001。(C)用DMSO或指示的抑製劑(UO126, 10µM;MK2206, 1 μ M)過夜，然後在37°C下加入Ad-CM 1h。將細胞裂解液進行SDS-PAGE檢測，並用相應抗體進行印跡。(d) b16f1 ()及E0771 ()細胞分別在添加不同濃度UO126或MK2206的Ad-CM或Ad-CM中培養3天。第3天定量細胞數。數據從兩個獨立的實驗中取平均值，並以Ad-CM的百分比表示。
為了闡明哪些下遊信號在調節ad - cm支持的腫瘤細胞增殖，我們選擇研究ERK和AKT通路，因為它們通常是細胞存活和增殖以及黑色素瘤和乳腺癌進展的眾所周知的調節因子[23-25]。我們觀察到，在B16F1和E0771細胞中添加Ad-CM可導致ERK磷酸化，MEK/ERK抑製劑UO126可完全消除ERK磷酸化(圖4c -上麵板)。同樣，Ad-CM還誘導AKT磷酸化，AKT抑製劑MK2206可抑製磷酸化(圖4C-lower panels)。當腫瘤細胞在UO126或MK2206的存在下在Ad-CM中培養時，在兩種腫瘤模型中，Ad-CM支持的細胞在第3天以劑量依賴的方式被抑製(圖4D和4E)。這些結果表明ERK和AKT通路的激活參與了Ad-CM刺激下B16F1和E0771細胞的增殖。
HSC-Ad分泌多種細胞因子(圖1D，補充圖S1)。為了確定哪些因子介導B16F1和/或E0771細胞增殖，我們評估了Ad-CM中存在的幾種細胞因子，包括HGF、IGF-1和VEGF。HGF和VEGF的重組蛋白均不促進腫瘤細胞增殖，其中和抗體也不抑製ad - cm促進的腫瘤細胞增殖(補充圖S2)。然而，與單獨使用αMEM相比，100 ng/mL重組IGF-1 (rIGF-1)刺激E0771細胞增殖(p<0.05)(圖5A)。添加IGF-1中和抗體(1µg/mL)可抑製ad - cm誘導的E0771細胞在第3天增殖約50% (p<0.05)(圖5B)。相反，rIGF-1不刺激B16F1細胞增殖(圖5A)， IGF-1中和抗體也不抑製ad - cm誘導的B16F1細胞增殖(圖5B)。IGF-1與調節IGF-1作用的IGF-1受體(IGF-1R)具有高親和力。Western blot證實E0771細胞的IGF-1Rβ表達水平明顯高於B16F1細胞(圖5C)。因此，選擇性IGF-1R抑製劑OSI-906 (Linsitinib)以劑量依賴的方式抑製ad - cm誘導的E0771細胞增殖(IC50 ~30 nM)，但對B16F1細胞增殖的影響最小(圖5D)。這些結果表明，IGF-1/IGF-1R信號軸在ad - cm誘導的E0771細胞增殖中起重要作用。 Unfortunately, a singular factor secreted by HSC-Ad that induced a profound stimulatory effect on B16F1 proliferation could not be identified in the studies herein.
圖5:胰島素樣生長因子1 (IGF-1)/IGF-1受體(IGF-1R)信號軸負責hsc - ad刺激E0771細胞體外增殖- (A)腫瘤細胞在無血清的MEM或添加100 ng/mL重組胰島素生長因子-1 (rIGF-1)的αMEM中培養3天。細胞數量在第3天進行量化，並從多個實驗中取平均值。數據以αMEM百分比表示。(B)腫瘤細胞在Ad-CM或添加1µg/mL IGF-1中和抗體的Ad-CM中培養3天。細胞數量在第3天進行量化，並從多個實驗中取平均值。數據以Ad-CM的百分比表示。(C) western blot比較B16F1和E0771細胞中IGF-1R的水平，β-actin作為加載對照。(D) B16F1 ()及E0771 ()細胞分別在添加不同濃度IGF-1R抑製劑OSI-906的Ad-CM或Ad-CM中培養3天。細胞數量在第3天進行量化，並從三個獨立的實驗中取平均值。數據以Ad-CM的百分比表示。* p < 0.05。n.s.，不重要。
除了腫瘤生長外，腫瘤細胞的遷移也是腫瘤轉移和進展的重要方麵，因此我們也研究了HSC來源的脂肪細胞對腫瘤細胞運動的影響在體外．如圖6所示，Ad-CM促進B16F1細胞(圖6A)和E0771細胞(圖6B)的遷移程度高於對照αMEM(分別p<0.001)。研究人員測試了HSC-Ad分泌的許多因子介導B16F1和E0771細胞遷移的能力。我們觀察到，與單獨αMEM相比，重組HGF (rHGF)有效地促進了B16F1和E0771細胞的遷移(p<0.001)(圖6C)， HGF存在於Ad-CM中(圖6D)。使用抗HGF抗體從Ad-CM中去除HGF，消除了Ad-CM誘導的B16F1細胞遷移(圖6A)，也顯著抑製了adcm誘導的E0771細胞遷移(p<0.01)(圖6B)，然而，與單獨使用αMEM相比，這種抑製是部分的(p<0.05)(圖6B)。ELISA證實Ad-CM分泌的HGF完全消失(圖6D)。
圖6:肝細胞生長因子(HGF)/c-Met對B16F1和E0771細胞遷移很重要——(A) B16F1細胞和(B) E0771細胞，未處理或用1µM c-Met抑製劑PHA-665752處理，暴露在指定培養基中4小時。從多個實驗的10個HPFs中統計遷移的細胞數量和平均細胞#。Ad-CM/del HGF, Ad-CM HGF的免疫缺失。(C)將腫瘤細胞暴露於100 ng/mL的重組HGF (rHGF)中4小時。從多個實驗中統計遷移的細胞並取其平均值。(D)用HGF酶聯免疫吸附試驗試劑盒(R&D Systems)對指定培養基中的HGF濃度進行定量和平均。NA，未檢測到。(E)用FACS分析比較腫瘤細胞表麵c-Met水平(實線)，同型IgG(虛線)作為對照。(F) E0771細胞，未處理或用1µM PHA-665752處理，暴露於100 ng/mL rHGF中4小時。從多個實驗中計算遷移的細胞並取平均值。*p≤0.05，**p<0.01， ***p<0.001。n.s.，不重要。
受體酪氨酸激酶(RTK) c-Met是HGF的表麵受體，並介導HGF的作用。通過流式細胞術，我們發現B16F1和E0771細胞表麵均有c-Met表達，B16F1細胞的c-Met表達明顯高於E0771細胞(圖6E)。當用c-Met選擇性抑製劑PHA-665752(1µM)處理B16F1和E0771細胞時，Ad-CM誘導的B16F1細胞遷移完全被消除(圖6A)，而與單獨使用Ad-CM相比，E0771細胞遷移僅被部分抑製(p<0.05)(圖6B)。在PHA-665752處理後，E0771細胞向rHGF的遷移被取消(圖6F)，這證實了HGF/c-Met通路的完全阻塞，並提示Ad-CM含有HGF以外的因子，有助於E0771的遷移。然而，這些結果揭示了HGF/c-Met信號軸在HSC-Ad指導下B16F1和E0771細胞運動中的關鍵作用。
為了揭示介導E0771細胞遷移的其他因素，用Ad-CM刺激E0771細胞，並將裂解物進行磷酸化tk陣列(R&D Systems)，結果表明PDGF α-和β-酪氨酸激酶受體(PDGFR和PDGFRβ)被激活並酪氨酸磷酸化(補充圖s3a左圖)。相反，在ad - cm刺激的B16F1細胞中檢測到的主要事件是磷酸化c-Met的增加，加強了HGF/c-Met通路的意義(補充圖s3a -右圖)。為了驗證陣列數據，用Ad-CM對E0771細胞進行不同時間點的刺激，並用磷酸化PDGFRβ和PDGFRβ抗體對裂解物進行印跡。Western blot證實Ad-CM刺激確實導致PDGFRβ酪氨酸磷酸化和受體降解，這是RTK激活的兩個標誌(補充圖S3B)。
PDGF家族由A-， B-， C-和d -多肽鏈的二硫鍵合同源二聚體和異源二聚體PDGF- ab組成。PDGF亞型通過結合和激活PDGFRα和PDGFRβ發揮其生物學功能，它們參與了包括乳腺癌[26]在內的許多腫瘤的進展。Western blot結果顯示PDGFRα和PDGFRβ在E0771細胞中表達，而在B16F1細胞中未檢測到(圖7A)。與單獨使用αMEM相比，重組PDGF-BB (rPDGF-BB)能夠促進E0771細胞的遷移，但不能促進B16F1細胞的遷移(p<0.01)(圖7B)。Ad-CM中檢測到PDGF-BB(圖7C)。
圖7:western blot檢測B16F1和E0771細胞中血小板衍生生長因子- bb (PDGF- bb)介導E0771細胞遷移-(A) PDGF受體α/β (PDGFRα/β)水平，β-actin為負載對照。(B)將腫瘤細胞暴露於αMEM或100 ng/mL的重組PDGFBB (rPDGF-BB)中4小時。從多個實驗中統計遷移細胞並取其平均值。(D)用PDGF-BB ELISA試劑盒(R&D Systems)對三種獨立Ad-CM製劑中PDGF-BB的濃度進行量化和平均。NA，未檢測到。(D) E0771細胞，未處理或用100 nM PDGFRα/β抑製劑CP-673451處理或1 μ M PHA-665752和100 nM CP-673451的組合，暴露在指示介質中4小時。從多個實驗中對遷移的細胞進行計數和平均。* * * * * p < 0.01, p < 0.001。n.s.，不重要。
當用PDGFRα/β選擇性抑製劑CP- 673451 (100 nM)處理E0771細胞時，ad - cm誘導的E0771細胞遷移顯著降低(p<0.01)，但抑製是部分的(p<0.001)(圖7D)。同時，CP-673451處理完全消除了E0771細胞向rPDGF-BB的遷移，表明PDGFR激活完全被阻斷(圖7D)。當用CP-673451和PHA-665752聯合處理E0771細胞時，ad - cm誘導的E0771細胞遷移被進一步抑製(p<0.001)(圖7D)。值得注意的是，CP-673451和PHA-665752加在一起並沒有完全消除ad - cm誘導的E0771遷移(p<0.01)(圖7D)，這表明除HGF和PDGF-BB外，其他因子也可能在E0771細胞遷移中發揮作用在體外．
在此，我們研究了單核細胞前體造血幹細胞衍生脂肪細胞的分化和成熟及其對癌症進展的潛在貢獻。單核細胞前體的生成依賴於M-CSF[27]。在缺乏M-CSF或M-CSF受體的小鼠中，血液單核細胞和組織巨噬細胞的數量顯著減少[28,29]。有趣的是，M-CSF還參與脂肪細胞增生/肥大和脂肪組織生長的生理調節[30,31]，突出了單核細胞參與脂肪組織發育。我們的研究結果表明，單核細胞前體產生了具有多室油滴的未成熟脂肪細胞，當受到適當的脂肪環境的影響時，這些脂肪細胞能夠進一步成熟。成熟HSC-Ad不表達造血標誌物CD45[19]。
腫瘤血管化被認為可以加強腫瘤的氧氣和營養供應，促進腫瘤生長。這一過程受到多種促血管生成因子的調控，包括內皮細胞和祖細胞增殖的一般激活因子VEGF。我們觀察到HSC-Ad與腫瘤細胞共注射導致血管管腔腫大可能是由於HSC-Ad分泌的VEGF增加了血管周圍內皮細胞的數量，從而使管腔麵積擴大。
HSC-Ad分泌的生長因子和脂肪因子發揮腫瘤類型特異性作用。在癌細胞增殖、腫瘤生長和腫瘤血管化方麵，與E0771乳腺癌細胞相比，B16F1黑色素瘤細胞對HSC-Ad的影響更敏感。然而，該研究中測試的單個因素都沒有顯示出對B16F1細胞增殖的決定性貢獻。我們推測HSC-Ad介導B16F1腫瘤生長通過多種生長因子及其同源受體的共同作用，而沒有任何一種通路是顯性的。另一方麵，E0771細胞對IGF-1刺激有反應，IGF-1R表達水平遠高於B16F1細胞，提示HSC-Ad更多依賴IGF-1/IGF-1R信號通路調控E0771腫瘤生長。IGF-1R激酶的選擇性抑製劑已被證明可以抑製MCF-7人乳腺癌細胞[33]的存活和錨定獨立生長。目前，超過10種IGF/ IGF- 1r抑製劑正在臨床研究中，用於各種癌症，包括乳腺癌[34]。我們的發現表明了這些抑製劑可能發揮作用的另一種機製。
細胞遷移是癌症進展的一個關鍵方麵，與轉移有關。細胞表麵受體酪氨酸激酶c-Met和PDGFR與配體結合後，激活多種信號級聯，誘導細胞生長、存活和運動[35,36]。HGF/c-Met和PDGF/PDGFR信號通路的高活性發生在不同類型的癌症中，並與腫瘤細胞不受控製的生長、上皮細胞向間質轉化、侵襲性和轉移有關[37,38]。針對c-Met酪氨酸激酶活性的小分子抑製劑已被證明可以預防幾種癌症模型的轉移，包括黑色素瘤[39,40]和乳腺癌[41,42]。我們證明HSC-Ad主要通過HGF/c-Met信號軸增強B16F1細胞遷移，而除了HGF/cMet信號軸外，PDGF/PDGFR信號通路對hsc來源的脂肪細胞促進E0771細胞遷移有顯著貢獻。與B16F1細胞相比，PDGF/PDGFR信號通路的影響可能是由於E0771細胞中PDGFRβ的高表達和c-Met的低表達，因此HGF/c-Met軸並不占主導地位，但對E0771細胞的運動仍很重要。這兩種途徑的抑製可能對抑製乳腺癌轉移有較好的效果。
雖然這些在體外數據證明了HSC-Ad分泌因子促進腫瘤細胞增殖和遷移的潛力，這些作用可能是由複雜的腫瘤微環境增強的，導致在共注射隊列中可見的腫瘤生長增強在活的有機體內．
HSC為脂肪細胞的生成提供了新的來源，但HSC- ad在正常情況下並不是脂肪組織發育的主要途徑[43]。然而，HSC-Ad在肥胖、癌症等病理條件下是否具有潛在作用，目前尚不清楚。我們假設在肥胖的發展過程中，循環的化學引誘劑(如MCP-1)水平的升高會將單核細胞招募到脂肪組織並分化為成熟的脂肪細胞。然後HSC-Ad分泌脂肪因子、炎症細胞因子和趨化因子，導致進一步增強單核細胞前體募集、HSC-Ad積累和免疫細胞浸潤。研究表明，HSC-Ad優先積聚在內髒脂肪組織(VAT)而不是皮下脂肪組織(SAT)，雌性小鼠比雄性小鼠[19]。VAT中的過度肥胖與2型糖尿病和某些類型的癌症特別相關，而過量的SAT則使這些疾病的風險低得多。此外，人體一般傾向於在VAT中不成比例地增加脂肪，體重指數的增加與黑色素瘤和乳腺癌呈正相關[45-47]。因此，HSC-Ads可能在脂肪相關腫瘤進展中起著不可或缺的作用，並代表女性患脂肪相關婦科癌症的更高風險。HSC-Ad可能代表了一種新的治療靶點，旨在抑製癌細胞的侵襲性和轉移能力，特別是在肥胖患者中。更重要的是，我們的工作表明，未來治療脂肪相關癌症的治療策略應該取決於腫瘤類型。
這項工作得到了NIH/NCI (R01 CA148772, a.c.l)、退伍軍人事務部生物醫學實驗室研究與發展計劃(優異獎，a.c.l)和霍林斯癌症中心(轉化研究試點項目，P30 CA138313, a.c.l)的部分支持。作者要感謝Dennis Watson博士提供E0771細胞係和Patricia Watson博士的技術支持。
作者宣稱他們沒有利益衝突。
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補充圖S1:HSC-Ad分泌脂肪因子- ad - cm受單獨elisa檢測(R&D係統)的影響。確定並定量了指示的脂肪因子。
補充圖S2:HGF和VEGF對於Ad-CM支持的腫瘤細胞增殖是不可缺少的。腫瘤細胞在(A) αMEM或100 ng/mL的HGF或VEGF中培養3天，(B) Ad-CM或Ad-CM中添加1µg/mL的抗HGF或抗VEGF中和抗體。細胞數量以αMEM (A)和Ad-CM (B)的百分比表示，無顯著差異。
補充圖S3:Ad-CM激活PDGFR信號-(A)未處理腫瘤細胞或在37°C下用Ad-CM處理5分鍾，細胞裂解液應用於Phospho-RTK陣列(R&D Systems)。數據顯示，Ad-CM刺激可增加E0771細胞(左圖)磷酸化pdgfr α/β水平，增加B16F1細胞(右圖)磷酸化cmet水平。(B) E0771細胞未處理或在37°C下用Ad-CM處理指定時間。將細胞裂解液進行SDS-PAGE檢測，並用相應抗體進行印跡。數據證實ad - cm刺激酪氨酸磷酸化和PDGFRβ激活E0771。
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