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文章類型:研究文章

引用:王曉明，王曉明，王曉明，等。(2016)核輸出化合物Selinexor對NF-κB的抑製作用及其對非小細胞肺癌的抑製作用。國際癌症研究分子力學2(2):doi http://dx.doi。org/10.16966/2381 - 3318.126

版權:©2016 Crochiere M，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可的條款發布，允許在任何媒介上不受限製地使用、分發和複製，前提是要注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年4月7日

接受日期:2016年4月27日

發表日期:2016年4月29日

摘要

非小細胞肺癌(NSCLC)即使有各種治療方案，預後也很差。不幸的是，耐藥性發展很快，需要新的治療方法。Exportin-1 (XPO1)是一種在多種癌症中表達上調的核輸出蛋白。口服選擇性核輸出抑製劑(SINE)化合物selinexor (KPT-330)抑製XPO1，可導致腫瘤抑製蛋白(tsp)的核積累、細胞周期阻滯和癌細胞死亡。Selinexor正在許多不同癌症適應症的I期和II期臨床試驗中進行評估，包括肺癌(NCT02351505)。迄今為止，selinexor已被用於>1400例患者，並顯示出良好的耐受性和可控製的副作用。本研究在體外和體外評估了selinexor對NSCLC細胞生長和凋亡的影響在活的有機體內．Selinexor抑製腫瘤細胞生長和克隆生成，並誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，與遺傳背景無關(EC50: 25-700 nM)。經selinexor處理4 ~ 24小時後，XPO1負載蛋白p53、p21、IκB、E2F4和survivin表現出強烈的核定位，隨後發生凋亡(即PARP、caspases-3和-8裂解)。Selinexor改變了NF-κB抑製劑IκB的定位，NF-κB在A549和NCI-H1299中的功能評估顯示，其EC50值與在細胞增殖試驗中測量到的抑製相似。與順鉑處理小鼠相比，用賽利諾處理小鼠的A549個異種移植瘤表現出明顯更大的腫瘤生長抑製作用(賽利諾處理20 mg/kg vs對照，%TGI=81%， p<0.0001)(順鉑處理5 mg/kg vs對照，%TGI=13%， p=0.06)。對石蠟包埋組織進行免疫組化，治療後的腫瘤細胞增殖降低(Ki67)，同時誘導p53、p21、FOXO1、survivin、NF-κB和IκB的核積累。在NSCLC中，selinexor可抑製TSPs的核保留，抑製腫瘤生長和NF-κB轉錄活性，並誘導細胞死亡，而與p53狀態無關。這些數據證明了NSCLC的治療潛力。

關鍵字

XPO1;非小細胞肺癌;Selinexor;茶匙;出口;癌症

簡介

在美國，肺癌是癌症相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌(NSCLC)包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌，約占所有肺癌的85%[1,2]。目前，現有的手術、化療、放療和靶向治療等方案獲益有限，晚期患者的5年總生存率≤10%，一期患者的>為70%。新型、有效且耐受性良好的藥物的設計，因涉及各種類型NSCLC的發生的複雜、知之甚少的分子機製而混亂。此外，大多數肺癌表現為彌散性疾病，並具有多種突變，使其最初或迅速對現有的治療方法產生耐藥性。在NSCLC中，腫瘤組織的基因組研究表明p53狀態可能是治療結果的預後指標。由於p53通路在化療或放療導致DNA損傷時參與啟動細胞周期阻滯和凋亡，因此p53突變(42%)或多態性(42%)或p53抑製劑MDM2過表達的NSCLC患者可能會降低標準治療[3]的療效。因此，不依賴於功能性p53的治療方法對於NSCLC是非常必要的。

肺癌細胞轉化的主要要求是腫瘤抑製蛋白(TSPs)如p53[4]的失活和細胞生存通路如NF-κB信號[5]的異常激活。正常TSP和NF-κB信號通路的中斷可以通過突變失活和/或這些通路中蛋白質亞細胞定位的改變(即p53、FOXO、IκB等)實現[6-8]。蛋白質通過核孔複合體的運輸是由一種稱為核啡素的蛋白質家族進行的;importins將含有核定位信號的貨物運輸到細胞核，而exportins將含有核輸出信號的貨物蛋白質(以及通過RNA結合蛋白的特定RNA分子)從細胞核運輸到細胞質[9-11]。大多數tsp調控轉錄，並需要核定位以實現其腫瘤抑製功能。另外，IκB核保留抑製NF-κB[7]的轉錄活性。因此，核輸出TSPs和IκB是中和其功能、促進腫瘤細胞生長的有效途徑。

雖然已知的核輸出蛋白有7種，其中出口蛋白1 (XPO1;染色體區域維護1;CRM1)被認為是大多數tsp的核轉運體，如p53 [12,13]， FOXO[14]和pRB[15]，以及>200其他貨物[16]。XPO1蛋白在包括肺癌在內的多種癌症中均有過表達，且與不良預後相關[17,18]。leptomycin B (LMB)是一種高效的XPO1天然產物抑製劑，其抑製XPO1可抑製p53野生型(wt)和p53突變型腫瘤的肺癌細胞生長並誘導細胞毒性，對正常支氣管上皮細胞[13]影響較小。雖然這些數據表明靶向XPO1治療肺癌的潛在有用性，但LMB(催產素)在臨床中被證明無效，因為其對人體的顯著毒性被認為與XPO1抑製無關[19,20]。最近，強效小分子核輸出選擇性抑製劑(SINE)化合物selinexor (KPT-330)對XPO1的抑製已顯示出廣泛的臨床前抗癌活性和特異性[21]，目前正在多種不同癌症適應症的I期和II期臨床試驗中進行評估(看到clinicaltrials.gov，包括肺癌(NCT023515050)。據報道，另外的SINE化合物KPT-185和KPT-276在體外可誘導對非小細胞肺癌(NSCLC)的選擇性抗癌細胞毒性在活的有機體內[22]。然而，機械和在活的有機體內selinexor對NSCLC的影響尚不明確。在這裏，我們介紹了selinexor對NSCLC的影響，並證明XPO1是治療這種惡性腫瘤的潛在靶點。

材料與方法

細胞培養和試劑

細胞在添加10%熱滅活胎牛血清(FBS, Gibco)、100單位/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素(Gibco)和1X穀氨酰胺(Gibco)的rmi -1640培養基中培養，在37℃、5% CO的加濕培養箱中保存₂．NCI-H226、NCI-H520、NCI-H889、NCI-H1299、A549、NCI-H2122和NCI-H2030來自ATCC (Manassas, VA)。Selinexor由核藥治療公司(Newton, MA)合成。

細胞滴度96^®水細胞增殖試驗

對數相培養的約1萬個細胞在96孔平板培養皿中每孔100 μl。在孔中加入不斷增加濃度的selinexor，並在37°C加5% CO的加濕培養箱中培養₂72小時(一式三份)。然後，在每個孔中加入100 μ l MTT(3- 4,5 -二甲基噻唑基)- 2,5 -二苯四唑溴化銨5mg/mL, Promega)，在37°C下繼續孵育4h。每孔加入含DMSO和Sorenson緩衝液的增溶液100µl/孔。在染料完全溶解後，在ELISA閱讀器上在570nm處讀取板。計算各組重複的平均光密度(OD±SD)。整個過程重複了三次。細胞生長抑製率計算公式:%生長抑製=(處理過的1-OD提取物)/OD陰性對照× 100[23]。

克隆生存試驗

NCI-H1299和A549細胞在12孔板中以5000個/孔的速度被鍍(細胞處理)。第二天用DMSO (Sigma)、1µM selinexor (NCI-H1299)或5µM selinexor (A549)處理細胞。第0、4、6、8天細胞固定，用龍膽紫染色(RICCA Chemical Company)，數碼相機成像(Sony Cybershot)。然後將細胞溶解在10%的乙酸中(Fisher Scientific)，並在590 nm處測量OD。

流式細胞術

根據製造商的協議，使用BrdU Flow Kit (BD Pharmingen)進行細胞周期譜分析。簡單地說，NCI-H1299、A549和NCI-H2030細胞分別以50萬個細胞/孔的速度在6個孔板中電鍍，第1天，20萬個細胞/孔，第3天。NCI-H1299用DMSO或1µM selinexor處理細胞，A549用5µM selinexor處理細胞，NCI-H2030用10µM和60µM selinexor處理細胞。采集前，NCI-H1299和A549細胞用10µM BrdU孵育2小時，NCI-H2030細胞用10µM BrdU孵育4小時。根據製造商的規程，對細胞進行固定和BrdU和7-AAD染色。然後在Dana Farber癌症研究所(Boston, MA)的BD LSRFortessa (BD Biosciences)上分析細胞，隨後使用FCS Express 4軟件(De Novo software)分析數據。

免疫印跡

NCI-H1299和A549細胞以375,000個/孔的比例鍍於6孔板中，分別用DMSO(0)或30、100、300、1000或3000 nM selinexor處理24和48小時，然後胰酶收集。蛋白質從Pierce RIPA緩衝液(Thermo Scientific)中提取，並輔以磷酸酶和蛋白酶抑製劑(Roche)。蛋白質含量由Pierce BCA蛋白測定試劑盒(Thermo Scientific)測定，樣品歸一化，每個樣品每巷加載10 μg總蛋白。蛋白質通過裝載在Novex NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝膠(Life Technologies)上分離，並使用Novex iBlot凝膠轉移堆棧轉移到硝化纖維(Life Technologies)。采用以下一抗進行免疫印跡分析:PARP (Cell Signaling)、β-actin (Santa Cruz)、caspase 3 (Abcam)、caspase 8 (Cell Signaling)、caspase 9 (Cell Signaling)、XPO-1 (Santa Cruz)、p53 (Santa Cruz)、p21 (Abcam)、E2F4 (Santa Cruz)、FOXO3a (Cell Signaling)、survivin (Abcam)、NF-κB (Cell Signaling)、IκB (Abcam)。用紅外連接物種特異性二抗(LI-COR Biosciences)檢測蛋白信號。Western blot圖像用ODYSSEY紅外成像係統(LI-COR Biosciences)檢測。

免疫熒光

NCI-H1299和A549細胞被放置在玻璃蓋板上(BioCoat, BD Biosciences)，在6個孔板中以375,000個細胞/孔的比例培養過夜。用1µM selinexor處理細胞4小時以檢測p53和IκB，或24小時以檢測p21、E2F4和survivin。處理後，用1X PBS(磷酸鹽緩衝鹽水)清洗封麵，然後固定在3%多聚甲醛緩衝液(3%多聚甲醛/2%蔗糖/1X PBS)或100%冰冷甲醇中15分鍾，然後用1X PBS清洗。用0.1% Triton X-100/1% BSA/1X PBS (PFA固定)或0.1% Tween 20/0.3 M甘氨酸/1% BSA/1X PBS(甲醇固定)滲透細胞至少30分鍾。用1X PBS洗滌3次後，用1%BSA/1X PBS稀釋的上述抗體表染色過夜。用種特異性Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen)檢測蛋白信號，用DAPI (Invitrogen)染色DNA。蛋白質定位用尼康Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡(Nikon)和單色相機(ANDOR)進行。

動物模型

SCID小鼠購自新加坡國立癌症研究所(Dr. Shin Leng)。所有的動物實驗都是按照《動物福利指南》的指導方針進行的，並得到了IACUC的批準。六十(60)隻雌性CB-17 SCID小鼠(Charles River Labs品係代碼236)，年齡5 - 6周。治療前的平均體重為16.3克。小鼠左側皮下接種4 × 10⁷A549細胞。A549 (ATCC# cc -185) NSCLC細胞來源於ATCC。當腫瘤達到平均體積98.5 mm時開始治療^3.(SD = 21.2毫米^3.)．小鼠被分成6組，每組10隻小鼠，每組平均腫瘤體積在95 - 104 mm範圍內^3.．小鼠分別以10或20 mg/kg劑量給藥，標準護理藥物/陽性對照藥物(順鉑)或selinexor (KPT-330)治療。car和selinexor從第1天開始在周一、周三和周五給予，順鉑在第1天和第15天通過IP注射給予。每天記錄動物的體重和狀況，並在周一、周三和周五測量腫瘤。通過測量每個腫瘤的曲線下平均麵積(AUC)來分析腫瘤體積數據，並使用單向方差分析檢驗比較各組。

免疫組織化學

來自異種移植研究的腫瘤被固定並包埋在石蠟中。切片後行常規免疫組化(IHC)。簡單地說，切片通過二甲苯和酒精係列脫蠟，然後用3%的雙氧水處理。使用Cell Marque檢測係統(Cell Marque)檢索抗原。抗原通過裝載載玻片到Biogenex I6000自動免疫染色儀(Biogenex實驗室)上進行檢測。簡單地說，該項目包括20分鍾的背景阻斷劑，PBS衝洗，15分鍾的Biogenex Avidin阻斷劑，另一次PBS衝洗，接著是15分鍾的Biogenex生物素阻斷劑，PBS衝洗，20分鍾的Biogenex Power阻斷劑，然後將阻斷劑清除。應用一抗，室溫孵育1小時，然後用PBS衝洗。然後使用細胞標記檢測係統應用生物素化鏈接，並在PBS衝洗後孵育20分鍾。接下來應用鏈黴親和素標簽並孵育20分鍾，然後用PBS衝洗。最後，應用Cell Marque AEC染色原並孵育5分鍾，然後用去離子水衝洗兩次，用PBS衝洗一次。 Slides were transferred to tap water, counterstained in Hematoxylin for 10 dips, and then rinsed with tap water, followed by application of bluing reagent for 10 dips and rinsed with tap water. Cell Marque aqueous mounting media was added and slides were allowed to dry at room temperature overnight or for 20 minutes in an oven. Coverslips were mounted after a quick dip in xylene once dry. Antibodies used for detection of proteins by IHC were the following: Ki67 (Cell Marque), p53 (Santa Cruz), p21 (Cell Signaling), FOXO1 (Cell Signaling), survivin (Abcam), NF-κB (Santa Cruz), and IκB (Abcam).

NF-κB活性測定

NCI-H1299和A549細胞以20萬細胞/孔的速度在12孔板上鍍膜，按上述方法培養。對細胞進行一係列稀釋預處理(從30µM開始;1:3稀釋)selinexor 1小時，然後在無血清培養基中暴露於20 ng/ml TNFα (Peprotech) 4小時。處理後，用PBS衝洗細胞，用RIPA緩衝液裂解細胞。根據製造商的說明，使用化學發光轉錄因子檢測試劑盒(Thermo Scientific)檢測細胞中NF-κB的轉錄活性。簡單地說，從每個處理中提取1.5 mg/ml RIPA裂解的全細胞提取物，在96孔板中與NF-κB生物素化共識序列結合。結合一致序列的NF-κB轉錄因子先用NF-κB p65一抗孵育，再用酶標二抗孵育。將化學發光襯底添加到井中，並用光度計檢測產生的信號。采用XLFit 205模型計算IC₅₀曲線。

結果

Selinexor抑製NSCLC細胞係的生長

在晚期實體瘤患者的1期臨床研究中，劑量為3-85 mg/m²(2-50毫克)，C_馬克斯血清中selinexor的含量為30-1373 ng/mL[24]。為了測試selinexor在臨床相關濃度下是否抑製肺癌細胞的生長，我們選擇了7種NSCLC細胞係，並評估了它們的增殖能力和死亡易感性。在改良的MTT細胞毒性試驗中檢測的7個細胞係中，5個是敏感的(NCI-H2122, NCI-H226, NCI-H520, NCI-H889, NCI-H1299;電子商務₅₀<400 nM)， 1為中度敏感(A549;電子商務₅₀400 ~ 1000 nM)， 1為耐(NCI-H2030;電子商務₅₀9100 nM)(表1)。此外，對selinexor的敏感性與NSCLC亞型無關，也與p53或KRAS的突變狀態無關。EGFR和AKT的所有細胞均為野生型(表1)。這些結果與其他NSCLC細胞的發現一致，其中對selinexor的敏感性與常見的遺傳異常[25]無關。

表1:XPO1抑製對NSCLC細胞係的細胞毒性作用與基因型無關

為了進一步研究selinexor對增殖和細胞活力的影響，一個敏感的NSCLC細胞係，p53缺失NCI-H1299 (EC₅₀: 130 nM)和一種中敏感NSCLC細胞係p53野生型A549 (EC₅₀: 410-700 nM)，兩者都攜帶KRAS突變，被選擇用於後續分析。根據nci -海軍醫學腫瘤學分支，NCI-H1299的特征是NSCLC上皮細胞形態來源於淋巴結[26]，而A549是腺癌肺泡基底上皮細胞係[27]。

采用克隆原性試驗[28]評價賽力諾對腫瘤細胞生長的抑製作用。在8天的培養過程中，測試了selinexor對NSCLC克隆和細胞生長的影響。selinexor對敏感的NCI-H1299和中敏感的A549細胞係的細胞生長均有完全抑製作用(圖1)。用1µM selinexor處理NCI-H1299(圖1A)，用5µM selinexor處理A549(圖1B) 8天，通過目視檢查和對貼壁活細胞龍膽紫染色的光譜儀定量測定，可以完全抑製細胞生長。相比之下，載藥對照處理的NCI-H1299和A549細胞正常生長，直到第6天，它們變得過度融合，並開始因過度擁擠和死亡而減少(圖1)。在克隆原性試驗中，也對兩種細胞係進行了低濃度的selinexor測試，得到類似的結果(數據未顯示)。

圖1:Selinexor抑製NSCLC細胞係的細胞生長。
A) NCI-H1299和B) A549細胞以5000細胞/孔鍍膜，用DMSO(對照)或1µM selinexor (NCI-H1299)和5µM selinexor (A549)處理。細胞在第0、4、6、8天用龍膽紫染色並成像。NCI-H1299和A549的對照細胞正常生長，直到第6天它們變得過度生長。兩種細胞類型的相對生長是通過用10%的乙酸溶解細胞並在590 nm處測量OD來確定的。缺乏顏色檢測表明，selinexor治療抑製了NCI-H1299和A549細胞的生長。

selinexor的生長抑製可能通過多種機製實現。為了更好地理解這些機製，我們對載液和selinexor處理的NCI-H1299和A549細胞進行了細胞周期分析。在這些分析中，NCI-H1299和A549分別用1和5µM selinexor處理1天和3天，並通過流式細胞術評估BrdU摻入和DNA含量(圖2)。對敏感p53缺失的NCI-H1299細胞應用selinexor可減少但不消除S期，誘導G1阻滯，並以時間依賴的方式增加亞G1種群(圖2A)。相比之下，用selinexor處理p53野生型A549細胞完全消除了S期，誘導了顯著的G2和G1阻滯，並增加了亞G1(凋亡)細胞，盡管與selinexor處理的NCI-H1299細胞觀察到的程度不同(圖2B)。亞g1細胞群的增加與細胞死亡的增加相關，表明NCI-H1299細胞的細胞死亡程度高於A549細胞。這些數據提高了p53參與A549細胞中觀察到的顯著G2阻滯的可能性。

圖2:Selinexor誘導NSCLC細胞係生長停滯和細胞死亡。A) NCI-H1299和B) A549細胞分別用對照(無藥物)或1µM selinexor (NCI-H1299)或5µM selinexor (A549)處理，並與BrdU孵育2小時，然後收集並在培養的第1天和第3天固定。對固定細胞進行BrdU和7-AAD摻入染色，然後用流式細胞術評估每種細胞類型的細胞周期譜。

對耐藥最強的NSCLC細胞係NCI-H2030 (EC₅₀9.1 μM)(補充圖1)。對耐藥NCI-H2030細胞係用10 μM的selinexor處理3天的細胞周期分析顯示，S期減少，G1期相應適度增加，但沒有明顯的細胞死亡(補充圖1A)。雖然與臨床無關，但用60µM selinexor治療NCI-H2030細胞2天可減少S期和G1期，並增加G2期和細胞死亡(亞G1期)(補充圖1B)。到第3天，60 μ M selinexor導致所有NCI-H2030細胞死亡(數據未顯示)。這些結果表明，selinexor在耐藥NCI-H2030細胞中以時間和劑量依賴的方式誘導細胞周期停滯和細胞死亡，與在敏感NCI-H1299和中敏感A549細胞中相似。

Selinexor通過凋亡誘導細胞死亡

克隆實驗和流式細胞儀分析結果表明，selinexor誘導NSCLC細胞死亡。為確定selinexor是否誘導NSCLC細胞凋亡，采用Western blot方法分析凋亡標誌物。NCI-H1299和A549細胞分別用0、30、100、300、1000或3000 nM selinexor處理24或48小時(圖3)。在NCI-H1299細胞中，用>300 nM selinexor處理24小時導致全長caspase 3和PARP減少，並增加其裂解產物。這種模式也出現在A549細胞中，但caspase 3和PARP裂解需要更高的selinexor濃度，這與其他實驗的結果一致。有趣的是，我們觀察到內在和外在凋亡途徑之間的差異，在A549細胞中，caspase 8的裂解產物(外在的)比在NCI-H1299細胞中更為突出，並且在兩種細胞類型中，selinexor處理後全長caspase 9(內在的)水平都降低了(圖3)。這些結果表明，selinexor誘導了NSCLC細胞的外在和內在凋亡途徑，最終導致細胞死亡。此外，selinexor誘導細胞凋亡不依賴於p53，這與SINE化合物在實體瘤和淋巴瘤模型中對細胞凋亡的影響一致[29,30]。

圖3:Selinexor通過凋亡誘導細胞死亡。A549和NCI-H1299細胞的全細胞裂解物用0、30、100、300、1000或3000 nMselinexor處理24小時(PARP和相應的肌動蛋白)和48小時(caspases 3,8,9和肌動蛋白)的免疫印跡。CL =劈開，FL =全長。

Selinexor誘導多個tsp的核定位

免疫熒光顯微鏡用於闡明selinexor對關鍵tsp和細胞周期調節因子核積累的作用。與載體處理細胞的主要細胞質定位相反，1µM selinexor處理的NCI-H1299細胞中IκB、E2F4和survivin的核定位增強(圖4A)。由於NCI-H1299是p53的空細胞係(表1)，無論是否使用selinexor治療，都無法檢測到p53和p21 (p53依賴和不依賴的轉錄控製)。A549是p53野生型細胞係，經1µM selinexor處理後，所測tsp - p53、p21、IκB、E2F4和survivin -的核定位顯著增強(圖4B)。這些結果表明，selinexor誘導了幾種tsp的核定位，而不考慮p53狀態，並可能通過阻斷細胞核中的E2F4和survivin等細胞周期調節因子誘導細胞凋亡。

圖4:Selinexor在兩種NSCLC細胞係(A) NCI-H1299和B) A549中誘導多種tsp和轉錄調控因子的核定位。NCI-H1299和A549固定前用1µM selinexor處理4小時(p53和IĸB)或24小時(p21、E2F4和survivin)，然後進行免疫熒光顯微鏡檢查。

Western blot分析評價selinexor對tsp和其他細胞周期調節蛋白水平的影響。用增加量的selinexor處理NCI-H1299和A549細胞24小時，分析TSPs和其他轉錄調節劑的蛋白水平。盡管在A549和NCI-H1299中觀察到的XPO1在selinexor治療後的劑量依賴性下降是預期的，並且與先前發表的結果[22]一致，但FOXO3蛋白的劑量依賴性下降是出乎意料的，之前沒有在其他細胞係中觀察到(圖5)。p53和p21蛋白水平呈劑量依賴性升高，而與圖4A相似，NCI-H1299細胞中均未檢測到任何蛋白(圖5)。A549細胞中E2F4蛋白水平不受selinexor處理的影響，而NCI-H1299細胞中E2F4蛋白水平在較高濃度selinexor處理時略有下降。selinexor處理後，兩種細胞類型的survivin蛋白水平均未發生改變(圖5)。這些數據表明，selinexor可以調節蛋白的定位和表達，以抑製細胞周期進程並誘導凋亡。

圖5:Selinexor在兩種NSCLC細胞係中誘導了幾種TSP和轉錄調控因子的蛋白表達變化。用0、30、100、300、1000或3000 nMselinexor處理A549和NCI-H1299細胞的全細胞裂解物24小時的免疫印跡。

Selinexor和NF-κB通路

NF-κB/IκB通路因其在癌症表現和進展中的作用而被廣泛研究。結果表明，selinexor治療可誘導IκB的核積累在體外(圖4)，我們評估了selinexor對體外NSCLC細胞NF-κB活性和蛋白表達水平的影響(圖6)。NCI-H1299和A549細胞用連續稀釋的selinexor預處理1小時，然後用TNFα刺激4小時，然後評估NF-κB p65亞基在NF-κB活性測定中結合一致結合序列的能力。在本實驗中，selinexor被證實具有NF-κB IC₅₀NCI-H1299細胞為0.78µM, IC略高₅₀在較不敏感的A549細胞中為1.19µM(圖6A)。在隨後的western blot分析中，0、30、100、300、1000或3000 nM selinexor處理24小時後，A549和NCI-H1299細胞中NF-κB p65和IκB蛋白水平均呈劑量依賴性降低(圖6B)。因此，Selinexor可能通過將IκB保留在細胞核中來抑製NF- κB通路的激活，在細胞核中，Selinexor可以中和NF- κB的轉錄活性，從而防止NSCLC細胞的下遊促生存事件。

圖6:Selinexor在A549和NCI-H1299細胞係中調節NF-ĸB活性並降低NF-ĸB和IĸB的蛋白表達，而與p53狀態無關。A) NCI-H1299和A549細胞用0.12、0.37、1.1、3.3、10和30 μ M selinexor在無血清介質中處理1小時後，加入20 ng/ml TNFα 4小時，NF-ĸBIC50測定。NF-ĸB IC50值由NF-ĸB結合試驗中評估NF-ĸB活性的總細胞裂解液計算。B) A549和NCI-H1299細胞的全細胞裂解物用0、30、100、300、1000或3000 nM selinexor處理48小時的免疫印跡。

selinexor對NSCLC細胞的影響在活的有機體內

接下來評估selinexor的效果在活的有機體內在小鼠異種移植模型中，中敏感NSCLC A549的生長。小鼠皮下接種A549細胞，當腫瘤達到平均體積約100 mm時^3.，對小鼠的處理如表2所示。Selinexor對A549異種移植生長的抑製表現出劑量依賴性，與對照組相比，Selinexor 20 mg/kg組的最大平均抑製率為81%(圖7A)，與順鉑組相比，最大抑製率為13%。圖7B測量並報告平均腫瘤體積變化。該分析表明，載藥對照組與selinexor治療組10 mg/kg (p=0.001)和20 mg/kg (p<0.0001)之間存在統計學差異。

圖7:在A549異種移植模型中，selinexor治療減少了腫瘤的平均體積。A.平均腫瘤體積由長度和寬度測量計算。計算組均值，並用誤差條表示每組的掃描電鏡。B.曲線下麵積(Area Under The Curve, AUC)是利用研究中每個動物測量的腫瘤體積的梯形規則轉換來計算的。計算組均值，並用誤差條表示每組的掃描電鏡。采用方差分析(ANOVA)對各組進行比較，載藥對照組與selinexor治療組10 mg/kg (p=0.001)和20 mg/kg (p<0.0001)之間有統計學差異。

表2:A549個異種移植物研究組

為了更好地理解selinexor如何抑製小鼠異種移植模型中的腫瘤生長，在第31天采集腫瘤並進行免疫組化(IHC)。圖8所示為各組對照和selinexor治療腫瘤的代表性圖像。蘇木精和伊紅(H&E)染色顯示了使用和不使用selinexor治療腫瘤的整體結構(圖8A)。Selinexor治療的腫瘤表現出更多的間質(纖維化)和更少的腫瘤細胞。與Ki67染色降低的對照組相比，selinexor治療降低了腫瘤細胞增殖(圖8A)。盡管在selinexor處理的腫瘤中p53和p21的染色與載體處理的腫瘤相比沒有差異，但與載體處理的腫瘤相比，selinexor處理的腫瘤顯示FOXO1和survivin的核積累增加(圖8B)。由於selinexor治療在體外NSCLC中誘導了IκB的核定位，調節了NF-κB活性，降低了NF-κB和IκB的表達(圖4和圖6)，因此在體內也評估了selinexor治療對這一途徑的影響。在用selinexor治療的腫瘤中，與載體治療的腫瘤相比，NF-κB和IκB的核定位都有所增加(圖8C)。NF-κB和IκB的核共定位與NF-κB活性的抑製有關[7,8]，這與selinexor體外對NF-κB的作用一致(見上文)。這些發現表明，selinexor在體外和體外誘導蛋白的核積累在活的有機體內並調節導致NSCLC細胞周期阻滯和死亡的多種途徑。

圖8:A549異種移植物組織學。Selinexor誘導eda)減少增殖(Ki67減少)，B) FOXO1和survivin的核積累，C) NF的核積累-ĸBand IĸB (40x)。
補充圖1:nci - h2030細胞在A) 10 μ M時對selinexor耐藥，而在B) 60 μ M時對selinexor耐藥。參見圖2對流式細胞術分析細胞周期的描述。用EC50濃度的selinexor(10µM)處理的耐藥NCI-H2030細胞S期縮短，G1相應適度增加，無明顯細胞死亡。到第3天，60 μ M selinexor導致所有NCI-H2030細胞死亡。

討論

XPO1是一種核輸出蛋白，也是核球蛋白-β家族的成員，已被證明在各種不同的癌症類型中過表達。許多研究報道了SINE化合物抑製XPO1核輸出導致TSPs核積累，抑製細胞生長，誘導凋亡[10]。臨床sin化合物selinexor目前正在對晚期實體瘤患者(包括肺癌)進行評估(NCT02351505)，到目前為止，已經證明了可接受的安全性和臨床效益[24]。本研究的臨床前數據支持selinexor在NSCLC中的抗腫瘤活性和潛在的治療效果。在體外，selinexor以劑量和時間依賴的方式誘導細胞周期阻滯和凋亡，誘導TSPs和細胞周期調節因子的細胞質到核定位，並調節NF-κ b通路，而不受組織學亞型和突變譜的影響。在活的有機體內在小鼠異種移植模型中，selinexor比順鉑更有效，其組織學特征與體外數據一致。這些結果表明，selinexor是一種有效的NSCLC抑製劑。

本研究直接詢問了在NSCLC中TSP p53是否是selinexor抗癌活性所必需的。與SINE化合物在其他癌症類型中的觀察結果一致[22,30,32]，selinexor在NSCLC中具有抗癌作用，無論p53狀態如何，在p53缺失NCI-H1299和p53野生型A549細胞係中也有類似的結果。這表明，盡管p53已被證明在細胞周期調節和凋亡誘導中起重要作用[33,34]，但這些事件並不需要通過selinexor治療來介導

雖然用selinexor治療NCI-H1299和A549的結果相似，但更仔細的檢查顯示，隨著時間的推移，它們對化合物的反應存在明顯差異，可能反映在它們對藥物的不同敏感性上。當用selinexor處理時，比較每種細胞類型的細胞周期輪廓，揭示了在細胞周期的不同階段細胞積累的差異。與A549細胞相比，NCI-H1299中凋亡細胞的亞g1比例更大，這反映了NCI-H1299細胞對selinexor更敏感。隨著時間的推移，亞g1群體在selinexor處理的A549細胞中預計會增加。然而，在NCI-H1299細胞中沒有觀察到A549細胞中G2阻滯的增加，這表明每個細胞係對selinexor的反應不同。盡管如此，當用selinexor處理時，兩種細胞類型最終都實現了細胞死亡，克隆原性試驗以及PARP裂解和caspase活性的western blot分析都證明了這一點。

大多數tsp的核定位是其主要細胞周期檢查點功能所必需的。癌細胞過表達XPO1和其他輔助因子導致關鍵TSPs的核排斥，包括p53, FOXO蛋白，p27，以及其他導致TSPs功能失活的因素，並有助於腫瘤細胞抵抗凋亡。抑製XPO1已被證明會導致細胞核中多種不同tsp的積累;輸出被阻止，但從細胞質中輸入不受影響[12-15]。sin化合物治療對癌細胞影響的一個顯著特征是許多參與癌症進展的蛋白質的核積累[29,32,35-38]。Survivin是細胞凋亡抑製劑家族(IAP)的成員，在多種癌症[39]中高度表達。Survivin增殖活性在細胞質[40]中發揮作用，其強製核保留可能導致[41]的泛素化和蛋白酶體降解。有趣的是，據報道，當觀察到survivin核定位時，骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌和肺癌患者的預後良好[42,43]。本研究的結果表明，selinexor介導的核包裹在體外和生存素在活的有機體內與癌細胞死亡有關。

除survivin外，selinexor處理也誘導了轉錄因子E2F4的核積累。E2F4是一種細胞周期調節劑，通過XPO1輸出到細胞質，使細胞進入細胞周期[44]。E2F4被限製在細胞核內時，與p107、p130和pRb這三種tsp結合，其結合對激活它們的抑瘤活性至關重要。Selinexor還誘導了pRB活性，磷酸化pRB的核檢測減少(未顯示)，p107和p130是否也被激活仍有待確定。與survivin和E2F4類似，selinexor誘導p53及其下遊靶點p21的核積累。p21結合並抑製cyclinCDK2和cyclin-CDK4複合物，因此在細胞周期[45]的G1期阻止細胞，如FACS分析所觀察到的(圖2)。

盡管其機製尚不完全清楚，但已有報道稱，在許多不同類型的癌症中，SINE化合物可增加NF-κB和IκB的核定位，並抑製NF-κB活性[32,35,38]。轉錄因子NF-κB通常在細胞質[5]中與其抑製劑IκB結合。活化後，NF-κB從IκB釋放，被IκB靶向降解，NF-κB進入細胞核上調與細胞周期進程和炎症相關的基因表達[46]。在負反饋回路機製下，IκB(本身是NF-κB調控的基因)進入細胞核以阻止NF-κB介導的基因進一步激活[47]。盡管NF-κB和/或IκB尚未被明確確定為XPO1貨物，但此前的體外研究表明，LMB處理誘導NF-κB/IκB複合物核保留，並抑製NF-κB活性，這歸因於IκBα n端核輸出信號[7,8]。在我們的研究中，selinexor通過誘導IκB在體外的核積累來抑製NF-κB通路在活的有機體內，以及兩種NSCLC細胞係中NF-κB和IκB蛋白水平的降低，這可能是由於它們自身轉錄上的負反饋環路。與A549細胞相比，在更敏感的NCI-H1299細胞中，較低濃度的selinexor可抑製NF-κB活性，這與A549細胞中觀察到的IκB基線胞質表達/定位增加一致。selinexor如何廢除NF-κB通路的潛在機製目前正在研究中。

先前在NSCLC細胞係中使用SINE化合物的臨床前研究結果與本研究的結果一致。對SINE化合物KPT-185和KPT-276(臨床候選selinexor的早期類似物)的評估顯示，在NSCLC細胞係和小鼠異種移植[22]中具有抗癌活性。然而，與selinexor報道的結果不同，之前的研究報告沒有影響NF-κB或IκB的表達。雖然它導致腫瘤生長減少，但用臨床無關劑量的sin化合物KPT-276治療小鼠。Sun等人在NSCLC中使用KPT-330 (selinexor)進行臨床前研究。[25]沒有檢測NF-κB通路，也沒有研究KPT-330對NSCLC的影響在活的有機體內對KPT-330進行組織學分析。在本研究中，我們比以往的研究更廣泛地評估了臨床相關XPO1抑製劑selinexor的細胞周期譜(3天與24小時)，研究了NF-κB通路，在小鼠模型中測試了臨床相關的藥物劑量，並對使用selinexor治療的腫瘤進行了徹底的組織學分析。無論測試的SINE化合物或評估的NSCLC細胞係如何，數據一致支持SINE化合物具有強大的抗癌活性。

NSCLC是肺癌的主要形式，其特點是預後差和治療選擇非常有限。盡管目前針對NSCLC[4]的靶向治療，但生存率仍然很低。selinexor對XPO1的抑製作用在活的有機體內導致了這項研究最令人興奮的方麵，即A549小鼠異種移植模型中平均腫瘤體積的巨大減少。與順鉑陽性對照相比，該治療耐受性良好，平均腫瘤體積顯著減小。Selinexor目前正在I期和II/IIb期臨床試驗中進行測試，無論是作為單一藥物還是與其他療法聯合用於治療各種實體和血液係統惡性腫瘤(Clinicaltrials.govNCT01607892和NCT01607905)。I期臨床研究的結果以及在活的有機體內本文的數據表明，XPO1抑製劑selinexor是一種很有前途的NSCLC治療新藥。

補充圖

補充圖1:NCI-H2030細胞在A) 10µM時對selinexor耐藥，而在B) 60µM時對selinexor耐藥。參見圖2對流式細胞術分析細胞周期的描述。用EC處理耐藥NCI-H2030細胞₅₀selinexor濃度(10µM)降低S期，G1相應適度增加，無明顯細胞死亡。到第3天，60 μ M selinexor導致所有NCI-H2030細胞死亡。

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