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文章類型:研究文章

引用:Okumura T, Kojima H, Hashimoto I, Watanabe T, Shibuya K，等(2016)trichorhino - phalangal綜合征-1 (TRPS1)表達缺失是胃癌患者預後不良的生物標誌物。國際癌症Res Mol Mech 2(2): doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.124

版權:©2016 Okumura T，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年11月11日

接受日期:2016年3月16日

發表日期:2016年3月21日

摘要

背景:Tricho-rhino-phalangeal syndrome-1 (TRPS1)是一種多鋅指核蛋白，已被報道在腫瘤發展和進展過程中調節細胞增殖、上皮-間充質轉化(EMT)、分化和凋亡。本研究旨在探討TRPS1表達在胃癌(GC)中的臨床病理意義。

材料與方法:采用組織微陣列(TMA)免疫組化技術檢測110例手術切除胃癌標本中TRPS1的表達。其中男性78例，女性32例。平均年齡68.4歲。患者TNM分期如下:I期17例;34歲的II期;第三階段,36個;IV期，23歲。經過兩名獨立研究人員的仔細檢查，這些患者的免疫組化結果根據強度和分布進行評分。此外，我們還獲得了10例胃癌患者的手術切除標本，免疫組化檢測TRPS-1的表達，並提取RNA檢測miR221和miR222等microRNA (miR)的表達。

結果:110例GC患者中，TRPS1高表達30例(27.3%)，低表達80例(72.7%)。TRPS1低表達與遠處轉移相關(p=0.01)。年齡、性別、腫瘤深度、淋巴結轉移、TNM分期和組織學分級與TRPS1表達無關。trps1低組的總生存率和原因特異性生存率明顯低於trps1高組(Wilcoxon p=0.043, p=0.048)。然而，TRPS1表達並不是患者的獨立預後因素。在10例手術切除的胃癌組織中，TRPS1的低表達與miR221和miR222的高表達顯著相關(p=0.017) (p=0.007)。

結論:TRPS1表達下調與遠處轉移相關，是GC患者的不利預後因素，為我們提供了新的預後標誌物和潛在的治療靶點。miR221和miR222可能參與了GC中TRPS1表達的調控。

關鍵字

胃癌;TRPS1;預後標記;免疫組織化學;miR221/222

簡介

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，在世界範圍內發病率不斷上升。盡管手術結果和化療藥物的改善，胃癌仍然是全球癌症相關死亡的第二大原因[2]。GC的發生與許多分子異常相關，包括各種腫瘤抑製基因的失活和/或各種癌基因的激活[3,4]。因此，需要對胃癌惡性特征的分子機製進行研究，為胃癌的早期發現和/或預後預測建立新的生物標誌物。

trichoo -rhino- phalangal syndrome-1 (TRPS1)是一種多鋅指核蛋白，與trichorhinophalangal syndrome (TRPS)有關，TRPS是一種以身材矮小、長骨末端呈錐形和與骨骼異常相關的獨特麵部特征為特征的遺傳疾病[5-7]。TRPS1在骨和軟骨發育過程中主要調控細胞增殖、上皮-間充質轉化(EMT)、分化和凋亡[8-13]。

此外，最近的報道顯示TRPS1在人類癌症中具有重要作用，如前列腺癌[14,15]、結腸[16]、子宮內膜[17]和乳腺癌[18-21]。據報道，TRPS1在乳腺癌中被miR221和miR222等microRNAs (miR)下調，並負調控EMT[22]。然而，它在胃癌中的作用尚未被研究。

本研究采用組織微陣列(TMA)免疫組化技術檢測胃癌組織中TRPS1的表達，分析其與臨床病理特征及患者預後的相關性。檢測miR221和miR222的表達，評估其表達與TRPS-1的關係。

材料和方法

病人

在我院2001年1月至2006年6月連續130例因原發性胃癌而行胃切除術的患者中，有110例因TMA部分部位癌細胞數量不足或染色過程中脫落而進行評估。其中男性78人，女性32人。患者平均年齡68.4歲。患者TNM分期(版本6)如下:I期17例;34歲的II期;第三階段,36個;IV期，23歲。IV期患者有遠處淋巴結轉移(M1淋巴)或單肝轉移(H1)，手術切除後無殘留腫瘤。術前和術後分別接受順鉑類化療19例和21例。中位隨訪時間為49個月，從1到151個月不等。

此外，我們從2014年1月至2015年1月在我院因原發性胃癌而行胃切除術的10例患者中獲得足夠大小的切除腫瘤及相應的正常胃粘膜冷凍標本提取RNA，並獲得福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)標本進行免疫組化染色。5名男性和5名女性。患者平均年齡為72.6歲。患者TNM分期(II/III期)和組織學(腸型/彌漫型)分別為4/6和4/6。所有患者術前均未接受化療。

本研究獲得了富山大學(#20-57)機構審查委員會的批準。

組織微陣列

用匹配的蘇木精和伊紅(HE)染色玻片選擇腫瘤區域，並直接在供塊上標記。每個圓柱形組織樣本從供體塊的選定區域取芯(直徑0.6 mm)，並直接擠壓到受體塊中。用切片機切割多個4 lm切片並轉移到玻片上(Superfrost Plus, Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany)[23]。

免疫組織化學

兔多克隆抗trps1抗體(稀釋1:100,Abcam Inc.， Cambridge, MA)用於免疫組化染色。將載有一抗的載玻片室溫孵育30分鍾。用KN緩衝液洗滌3次(KN-09002: Pathology Institute, Toyama, Japan)後，用ChemMate ENVISION K5027 (Dako, Glostrup, Denmark)孵育30分鍾，用KN緩衝液洗滌3次，然後用DAB (Dako)孵育10分鍾。顯影後，用蒸餾水衝洗兩次，用梅爾氏蘇木精輕微反染色，脫水，清除，用樹脂安裝介質安裝。所有步驟均在室溫下進行。

免疫組織化學分析

兩位研究人員分別對TRPS1的表達進行了獨立分析，並將表達強度分為0(無表達)、1(弱表達)、2(中度表達)、3(強表達)。他們還將表達分布分為0(無)、1(1-50%的腫瘤細胞)或2(51-100%的腫瘤細胞)。根據染色強度和分布之和評估TRPS1表達(TRPS-1 IHC評分)。

根據總分將患者分為低表達組(低組總分0-2分)和高表達組(高/高組總分3-5分)[23,24]。

microRNA的定量RT-PCR分析

根據標準方案，使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)從手術切除的GC組織和相應的正常胃粘膜的冷凍切片中提取總RNA。根據製造商說明(Applied Biosystems)，使用ABI Prism 7000實時PCR係統上的Taq Man microRNA逆轉錄試劑盒從總RNA樣本中製備cDNA。針對hsa-miR-221(試驗ID000524)、hsa-miR-222(試驗ID002276)和RNU6B(試驗ID 001093)預先設計的Taq Man microRNA測定法從應用生物係統公司購買。根據製造商的協議(應用生物係統公司)，使用Taq Man通用PCR主混合試劑盒進行qRT-PCR。對microRNA數量進行了重複分析，並將其歸一化以U6B作為內部對照。計算10例GC中每種miRNA的平均表達量(T/N比)並進行log2轉換。

統計分析

使用JMP v.11進行統計分析(SAS研究所公司，Cary, NC, USA)。臨床病理資料比較采用卡方檢驗、Fisher精確檢驗和t檢驗。采用Kaplan-Meier法計算各組術後總生存率，采用Wilcoxon檢驗評估差異。兩變量間microRNA表達水平的差異用Student 's t檢驗進行分析。一個p-值<0.05被認為有統計學意義。

結果

TRPS1在胃癌組織中的表達

利用組織芯片進行免疫組化染色，評估TRPS1的表達(圖1)。在適當評估的110例病例中，TRPS1在膜和細胞質中均有表達，但主要表達在腫瘤細胞的細胞質中，表達強度不同(圖2A和2B)。110例患者中，TRPS1高30例(27.3%)，低80例(72.7%)。TRPS1低表達與遠處轉移相關(p= 0.01)。而年齡、性別、腫瘤深度、淋巴結轉移、TNM分期和組織學分級與TRPS1表達無關(表1)。

圖1:組織芯片中TRPS1染色。

圖2:組織芯片腫瘤切片中TRPS1的代表性染色。(A) TRPS1高表達的腫瘤點。(B) TRPS1低表達的腫瘤斑點。黑色條表示200微米。

表1:TRPS1表達與臨床病理的相關性
TNM階段，版本6

trps1低組的總生存率和原因特異性生存率明顯低於trps1高組(Wilcoxon p=0.043和p=0.048;然而，TRPS1表達並不是患者的獨立預後因素(表2)。

圖3:與TRPS1表達相關的患者的總體(A)和原因特異性(B)生存曲線。TRPS1低表達患者的預後明顯差於TRPS1高表達患者(p=0.043和p=0.048)。

表2:患者資料的Cox多變量分析

TRPS-1表達與miR221/222表達的關係

與相應的正常胃黏膜相比，miR221和miR222的表達分別在10例檢查病例中的6例和10例檢查病例中的5例上調超過0.5 log2倍(圖4A)。TRPS-1在10例檢查病例中有2例表達，表達強度不同(圖5A和5B)。miR221表達上調與TRPS1表達下調相關(p=0.017，表3)，miR222表達上調與TRPS1表達下調相關(p=0.007，表4)。

圖4:miR221和miR222在手術切除胃癌冷凍標本中的表達(A) miR221的表達。(B) miR222的表達。計算每個miRNA的平均表達量(T/N比)並進行log2轉換。

圖5:miR221/222表達的腫瘤切片中TRPS1的代表性染色。(A) TRPS1高表達的腫瘤(病例8)。(B) TRPS1低表達的腫瘤(病例3)。黑色條表示100微米。

表3:手術切除標本中miR221表達與TRPS1表達的相關性

討論

最近的報道顯示TPRS1在控製各種類型癌症[25]的細胞周期和腫瘤發生的調節網絡中發揮核心作用，但其在胃癌中的作用尚未闡明。

我們對外科胃癌標本的免疫組化研究顯示，TRPS1的低表達與遠處轉移有關。TRPS1基因低的患者生存率明顯低於TRPS1基因高的患者，提示TRPS1基因下調參與了胃癌的進展和轉移。

我們的結果與最近的報道一致，TRPS1負調控EMT[22]並控製乳腺癌細胞周期進展和細胞增殖[25]。

另一方麵，據報道，TRPS1的表達增加參與了結腸癌[16]的發病機製，並且是一個獨立的不良預後因素，這表明在不同類型的癌症中TRPS1介導了不同的分子反應。

最近的研究表明，miR-221/222靶向TRPS1誘導乳腺癌[26]中的EMT，而miRNA-221下調TRPS1對胰腺癌細胞[27]中血小板衍生生長因子(PDGF)介導的EMT至關重要。在胃癌中，miR-221高表達被報道與晚期腫瘤-淋巴結轉移分期、局部浸潤和淋巴轉移[28]顯著相關。miR-221的過表達也被報道為胃癌[28]患者的不利預後因素。另一份報告顯示，miR-221和miR-222調節胃癌細胞係[29]的細胞生長和侵襲。

結合我們目前的研究結果，TRPS-1的低表達與miR221和miR222的高表達顯著相關，提示miR221/222也可能以TRPS1為靶點誘導胃癌惡性表型。轉染miR221/222表達載體的胃癌細胞係，評估TRPS1的下調隨惡性表型的進展，可能為我們提供TRPS1預後意義的基礎和新的治療靶點。

結論

綜上所述，我們的研究結果提示TRPS1表達下調與遠處轉移相關，是胃癌患者不良預後因素，為我們提供了新的預後標誌物和潛在的治療靶點。

致謝

本研究得到了MEXT KAKENHI科學研究資助基金(C)的支持。

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