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Aritcle類型:研究文章

引用:Peerschke EIB, Brandwijk rj, Dembitzer FR, Kinoshita Y, Ghebrehiwet B(2015)血液和體液中的可溶性gC1qR:胰腺癌患者隊列的檢查。國際癌症Res Mol Mech雜誌1(3):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.110

版權:©2015 Peerschke EIB，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年8月01

接受日期:2015年8月29日

發表日期:2015年9月3日

摘要

背景:gC1qR是一種與炎症和癌症有關的多功能細胞蛋白。與正常組織相比，gC1qR在腺癌中高度上調，可溶性gC1qR (sgC1qR)已被檢測到在體外在增殖惡性細胞的細胞周環境中。

目的:本研究通過免疫組化方法探討gC1qR在胰腺癌中的組織表達，以及sgC1qR的存在在活的有機體內通過檢查轉移性胰腺腺癌患者的血液和惡性積液，我們發現了這種方法。

方法:免疫組化觀察gC1qR在胰腺癌組織中的表達。使用新開發的敏感免疫捕獲夾心ELISA法，對健康誌願者(n=20)和胰腺癌患者(n=34)的血清以及惡性胸膜(n=23)和腹膜積液(n=27)中的SgC1qR進行了定量。

結果:與非惡性胰腺組織相比，gC1qR在胰腺腺癌中被證實過表達。此外，與健康對照組(0.15 + 0.10 ng/ml)相比，轉移性胰腺癌患者血清sgC1qR水平升高(0.29 + 0.22 ng/ml)(平均值+ S.D.) (p=0.035)。在16例患者中，有11例患者的血清sgC1qR水平隨疾病進展而升高，並與腫瘤生物標誌物CEA和CA19.9的變化平行。除血液外，惡性胸膜(0.55 + 0.47 ng/ml)和腹膜積液(0.57 + 0.38 ng/ml)中均檢出sgC1qR。

結論:本研究為sgC1qR在體內的存在提供了第一個證據。在血液和體液中檢測sgC1qR的能力將使進一步研究闡明其在惡性腫瘤中的病理生理學。

關鍵字

gC1qR;血;胰腺癌;腹水;補充;ELISA

簡介

gC1qR是一種33 kDa的多功能細胞蛋白，與炎症[1]和惡性[2]有關。它最初被認為是C1q球狀頭的受體[3-5]。gC1qR定位於線粒體[6-9]、內質網和細胞核以及細胞表麵，在細胞表麵它似乎與脂質筏有關[5,10-15]。

gC1qR調節細胞內外配體活性的能力日益被人們所認識。已經確定了幾種結合夥伴，包括C1q[3,16]，玻璃連素[17]和高分子量肌激肽原[18-20]。這些相互作用導致經典補體通路激活，產生炎症細胞因子[21,22]，以及激肽係統激活，產生緩激肽和隨之而來的血管通透性[22]。gC1qR對氧化磷酸化[6]的維持也很重要，而gC1qR的穩定下調已被證明可以將代謝從氧化磷酸化轉移到糖酵解[23]。此外，gC1qR被認為是細胞增殖、粘附、遷移和侵襲的潛在調節因子[15,24]。

我們假設gC1qR可能在致癌過程中起作用。事實上，與非惡性腫瘤相比，gC1qR在多種腫瘤中表達差異已被報道，特別是上皮性腫瘤[25,26]。gC1qR在細胞膜上的表達已被證實能促進腫瘤細胞的遷移和侵襲在體外[27]，最近的證據表明gC1qR在原發性卵巢癌中過表達與總生存期和無進展生存期[28]降低相關。觀察到gC1qR表達增加也發生在良性炎症和增生性病變[26]中，提示gC1qR表達增加可能是細胞增殖的標誌，具有潛在的診斷和治療應用。

除了細胞gC1qR表達外，可溶性gC1qR (sgC1qR)也被觀察到在體外[21]。sgC1qR可能發揮強大的生理作用，包括激活補體、凝血和激肽係統。此外，sgC1qR被證明與培養的內皮細胞結合，並誘導緩激肽/B1受體[29]，促進血管生成素[30]。

sgC1qR的存在在活的有機體內尚未建立。本研究開發了一種可靠的、高靈敏度的ELISA來篩查血液和體液，作為sgC1qR存在原理的證明在活的有機體內．來自健康誌願者和胰腺癌患者的血清樣本進行了檢測。此外，評估惡性胸膜和腹膜積液。這些數據為血液和惡性體液中存在sgC1qR提供了明確的證據，並提示sgC1qR水平可能隨疾病進展而變化。量化sgC1qR水平的能力將使gC1qR生物學在健康和疾病方麵的進一步研究成為可能。

方法

生物樣本

根據機構審查委員會批準的協議，胰腺腺癌的組織學切片從紐約西奈山醫學院病理係的檔案中獲得。對存檔的石蠟包埋組織切片(4m厚)進行免疫組化分析，如前所述[26]。

在完成所有診斷檢測後，從紐約州紀念斯隆-凱特琳癌症中心(MSKCC)的臨床實驗室獲得殘留患者血清(n=34)以及腹膜(n=27)和胸膜(n=23)液體樣本。從臨床實驗室血清庫中提供健康誌願者的血清。血清和惡性胸膜或腹膜積液的樣本來自晚期(IV期)胰腺癌患者。在納入研究之前，對所有血液和體液樣本進行了去鑒別。這項研究得到了MSKCC人體受試者保護機構審查委員會的批準。

sgC1qR分析

sgC1qR與新的在體外一種用於定量測定血漿、血清、培養上清和體液中sgC1qR的檢測方法(Hycult Biotech, Uden, the Netherlands)。根據生產說明書進行檢測。簡單地說，塗有抗gC1qR抗體(HM2014)並與牛血清白蛋白進行非特異性結合的阻斷的ELISA板/孔(Nunc, Thermo Scientific, Netherlands)被清洗，與重組gC1qR標準品或樣品孵育，在稀釋緩衝液(PBS/0.1%BSA)中稀釋1小時。4次洗滌後，將孔與生物素化多克隆抗gc1qr抗體在稀釋緩衝液中室溫反應1小時。洗滌後，結合物與鏈黴親和素結合的馬蘿卜過氧化物酶(HRP)反應。通過加入四甲基聯苯胺(TMB)襯底進行顯色。用酸性緩衝液停止反應。在450nm處用微板讀卡器測量吸光度。sgC1qR定量是通過比較患者或對照樣本TMB底物的裂解，相對於一組濃度從0-20 ng/ml的重組gC1qR標準來實現的。

腫瘤生物標誌物CEA和CA19.9的測定

血清CEA和CA19.9水平在MSKCC的臨床生物化學實驗室使用Tosoh AIA 2000 (Tosoh USA, Grove City, OH)上的熒光酶免疫測定法測定，作為患者臨床評估的一部分。CEA (0-5 ng/ml)和CA19.9 (0-40 ng/ml)的參考範圍由執行實驗室確定。

數據分析

計算個別數據集的平均值和標準差。數據集之間的統計學顯著性分析采用Mann-Whitney U檢驗(未配對數據)或Student t檢驗(配對數據)。顯著性定義為p<0.05。

結果

圖1顯示了gC1qR在惡性和良性胰腺組織中的表達。惡性細胞中gC1qR表達明顯。相對於良性細胞，在光鏡下可見外分泌胰腺惡性細胞中密集的細胞質gC1qR包涵體。低(20倍)和高(100倍油浸)放大視圖顯示。

sgC1qR ELISA

采用新開發的夾心ELISA法檢測sgC1qR。捕獲抗體(小鼠單克隆抗體)和檢測抗體(兔抗人gC1qR多克隆抗體)的最佳組合是基於最優信噪比(數據未顯示)。在沒有捕獲或檢測抗體的情況下，未獲得信號(數據未顯示)。測定結果在0 ~ 20 ng/ml之間呈線性關係。在此濃度範圍內，吸光度與sgC1qR濃度之間的相關係數為0.99(圖2)。使用血清樣本或正常血漿，用EDTA或檸檬酸鈉抗凝(來自新澤西州富蘭克林湖Becton Dickinson的血液收集管)，加入已知濃度的重組gC1qR(加標樣本)，gC1qR回收率為>95%，檢測內變異性為17 + 3%。肝素抗凝血在gC1qR定量中產生虛假升高，因此不推薦使用(數據未顯示)。為了盡量減少基質效應，血漿/血清和體液樣品在試驗中被稀釋1:20

健康誌願者和胰腺癌患者血清中sgC1qR的水平

對健康誌願者和IV期胰腺癌患者的血清樣本進行了sgC1qR檢測。患者34例(男19例，女15例)，年齡40 ~ 83歲。健康誌願者20例(男10例，女10例)，年齡35-70歲。在健康誌願者的血清中檢測到sgC1qR，並且在胰腺癌患者中發現了升高的水平(p= 0.035)，盡管有顯著的重疊(圖3)。在3-12個月後的第二次隨訪中獲得的患者樣本中，sgC1qR水平隨著疾病進展進一步升高(p=0.005)。

為了進一步評估sgC1qR水平與疾病進展之間的關係，我們使用間隔3-12個月獲得的血清樣本對檢測了sgC1qR與腫瘤標誌物CA19.9和CEA之間關係的變化。盡管gC1qR與CA19.9或CEA之間的直接相關性無統計學意義(r分別為0.1056和0.1692)，但sgC1qR與腫瘤標誌物之間隨時間變化(增加/減少)的關係在75%的血清樣本(16對血清樣本中的12對)中顯示一致。隨著時間的推移，16個樣本中的11個樣本中sgC1qR、CEA和CA19.9水平升高，而在一個血清對中注意到sgC1qR、CEA和CA19.9水平下降。在其餘25%的樣本對中(16對中有4對)，腫瘤標誌物增加而sgC1qR水平降低。造成這種不一致的原因目前尚不清楚。

圖1:胰外分泌惡性細胞和正常細胞gC1qR(棕色染色)免疫組化染色。如圖所示，在低倍率(20倍)(麵板A)和高倍率(100倍油浸)(麵板B和C)下獲得的光學顯微圖像。

圖2:sgC1qR ELISA標準曲線的代表性結果顯示，在0 ~ 20 ng/ml範圍內，吸光度與sgC1qR濃度呈線性關係。

圖3:sgC1qR在正常血清和胰腺癌患者血清中的比較，分別於3-12個月的兩次就診(指定就診1和2)。數據以框狀和須狀圖表示，顯示sgC1qR水平的中位數和四分位範圍，表示sgC1qR水平的中間50%，框在框內。誤差條(須)表示上(25%)和下(25%)四分位數中的sgC1qR值。

惡性積液中的sgC1qR

惡性胸腔和腹膜穿刺液中也可測定sgC1qR水平(表1)。良性積液不可作比較。有趣的是，惡性積液中的sgC1qR水平似乎高於血清。

標本類型	N	sgC1qR (ng / ml) (平均±道。)
正常血清	20.	0.15±0.10
病人血清	34	0.29±0.22
胸膜液體	23	0.55±0.44
腹水	27	0.57±0.38

表1:胰腺癌患者血清和體液中sgC1qR水平的研究綜述

討論

炎症、補體和癌症密切相關，補體在致癌[2]中發揮拮抗和支持作用。據報道，gC1qR通過直接激活補體、激肽和凝血級聯[1]促進炎症。此外，gC1qR在腺癌和一係列上皮性癌症中也有過表達[25,26]。來自多個來源的數據表明gC1qR是一個潛在的治療和診斷靶點[28,31-34]。例如，在一個小鼠模型中，細胞gC1qR表達水平的變化似乎與腫瘤進展的特定階段[32]一致，在一項對63例乳腺癌患者的研究中，gC1qR mRNA表達水平與腋窩淋巴結轉移和患者生存能力差[34]相關。在卵巢癌患者中也報道了類似的觀察結果，其中gC1qR過表達與[28]預後差相關。

自sgC1qR被報道以來在體外在培養上清[21]中，並可能發揮血管生成和調節炎症的作用[1,2]，本研究采用一種新開發的定量分析方法來測定血液和體液中的sgC1qR。這些結果為可量化sgC1qR的存在提供了原理證明在活的有機體內．

在健康誌願者的血清中檢測到可測量的sgC1qR水平，在胰腺癌患者的血清中發現水平升高。有趣的是，隨著疾病進展，患者sgC1qR水平的變化被觀察到，其中許多變化與已知腫瘤標誌物的變化平行，如CEA和CA19.9。此外，惡性胸膜和腹膜積液中檢測到sgC1qR。盡管sgC1qR的來源尚未確定，但這些發現將支持從癌細胞中分泌sgC1qR，正如在在體外研究[21]。然而，不能排除炎症細胞或凋亡細胞分泌sgC1qR。

而目前的研究為sgC1qR的存在提供了原則性的證明在活的有機體內在血液和體液中，還需要進一步的研究來確定sgC1qR在癌症患者中的表達特征，並了解其病理生物學。本研究的局限性在於樣本量小，無法評估良性/傳染性或炎症性血液和體液。此外，需要匹配共病的患者和對照組來確定sgC1qR作為惡性腫瘤或炎症標記的特異性，特別是as在體外證據表明gC1qR通過炎性細胞因子[35]上調。本研究的結果鼓勵進一步研究sgC1qR在體外而且在活的有機體內．由於在ELISA中使用的gC1qR抗體與小鼠和大鼠gC1qR發生交叉反應，可以想象，該試驗可能適用於齧齒類動物模型中sgC1qR的研究。

確認

作者感謝紀念斯隆-凱特琳癌症中心的Adrienne Jarocki和Kajal Kothadia以及Hycult生物技術公司的Jan van Groningen提供的技術支持。

這項工作得到了美國國立衛生研究院(RO1 AI 060866和RO1 AI-084178)的部分資助。

參考文獻

1. Peerschke EI, Ghebrehiwet B (2007) gC1qR/p33在感染和炎症中的作用。免疫生物學212:333 - 342。［Ref。］
2. 王曉東，王曉東，王曉東(2014)cC1qR/CR和gC1qR/p33在癌症中的應用。Mol Immunol 61: 100-109。［Ref。］
3. Ghebrehiwet B, Lim BL, Peerschke EIB, Willis AC, Reid KB(1994)與C1q球狀頭結合的33-kDA細胞表麵糖蛋白的分離、cDNA克隆和過表達。中華醫學雜誌179:1809-1821。［Ref。］
4. Ghebrehiwet B, Peerschke EIB(1998)多配體結合膜蛋白gC1q-R的結構和功能。Immunobiol 199: 225 - 238。［Ref。］
5. Ghebrehiwet B, Lim BL, Kumar R, Feng X, Peerschke EI (2001) gC1qR/p33是一類與炎症和感染有關的多功能多室室細胞蛋白的新成員。免疫Rev 180: 65-77。［Ref。］
6. Muta T, Kang D, Kitajima S, Fujiwara T, Hamasaki N (1997) p32蛋白是一種剪接因子2相關蛋白，定位於線粒體基質，在維持氧化磷酸化中具有重要功能。生物化學雜誌272:24363-24370。［Ref。］
7. Dedio J, Jahnen-Dechent W, Bachmann M, Muller-Esterl W(1998)多配體結合蛋白gC1qR，推測為C1q受體，是一種線粒體蛋白。J免疫雜誌160:3534-3542。［Ref。］
8. Matthews DA, Russell WC(1998)腺病毒核心蛋白V與p32-一種與線粒體和細胞核都相關的蛋白質相互作用。病毒學報79:1677-1685。［Ref。］
9. Majumdar M, Meenakshi J, Goswami SK, Datta K(2002)透明質酸結合蛋白1 (HABP1)/C1QBP/p32是MAP激酶的內源性底物，在有絲分裂刺激時被轉移到細胞核。生物化學與生物物理學報291:829-837。［Ref。］
10. Braun L, Ghebrehiwet B, Cossart P (2000) gC1qR/p32, C1q結合蛋白是單核增生李斯特菌的一種新型受體。Embo j 19: 1458-1466。［Ref。］
11. Kittelson DJ, chinese - bullock KA, Yao ZQ, Braciale TJ, Hahn YS(2000)補體受體gC1qR與丙型肝炎病毒核心蛋白的相互作用抑製t淋巴細胞增殖。J臨床投資106:1239-1249。［Ref。］
12. Soltys BJ, Kang D, Gupta RS(2000)正常組織中p32蛋白(gC1q-R)在線粒體和特定線粒體外位置的定位。組織化學細胞生物學114:245-255。［Ref。］
13. Mahdi F, Madar ZS, Figueroa CD, Schmaier AH (2002) Factor XII與內皮細胞膜上尿激酶纖溶酶原激活物受體、gC1qR和細胞角蛋白1的多蛋白組合相互作用。血99:3585 - 3596。［Ref。］
14. Mahdi F, Shariat-Madar Z, Todd RF III, Figueroa CD, Schmaier AH(2001)內皮細胞角蛋白1和尿激酶纖溶酶原激活物受體的表達和定位。血液97:2342- 2350。［Ref。］
15. Kim KB, Yi JS, Nguyen N, Lee JH, Kwon YC, et al.(2011)細胞表麵受體補體成分C1q (gC1qR)是lamelli足形成和癌症轉移的關鍵調控因子。生物化學雜誌286:23093-23101。［Ref。］
16. Lynch NJ, Reid KB, van den Berg RH, Daha MR, Leigh LEA，等(1997)小鼠gC1qBP的同源物，一種33 kDA的蛋白質，結合在C1q的球狀“頭”上。FEBS萊特418:111-114。
17. Lim BL, Reid KB, Ghebrehiwet B, Peerschke EI, Leigh LA，等。(1996)補體C1q, gC1qR的“頭”結合蛋白的功能表達及其作為一種新型玻璃蛋白結合因子的特性，中國生物化學雜誌，271:26739-26744。［Ref。］
18. Herwald H, Dedio J, Kellner R, Loos M, Mueller-Esterl W(1996)內皮細胞激肽原結合蛋白p33的分離和表征。與gC1q受體同源。生物化學雜誌271:13040-13047。［Ref。］
19. Joseph K, Ghebrehiwet B, Kaplan AP(1999)細胞角蛋白1和gC1qR介導高分子量激肽原與內皮細胞的結合。臨床免疫學雜誌92:246-255。［Ref。］
20. Joseph K, Ghebrehiwet B, Peerschke EI, Reid KB, Kaplan AP(1996)高分子量激肽原和因子XII的鋅依賴性內皮細胞結合蛋白的鑒定:與與C1q (gC1q-R)球狀“頭”結合的受體鑒定。美國科學院學報93:8552-8557。［Ref。］
21. Peterson KL, Zhang W, Lu PD, Keilbaugh SA, Peerschke EI，等(1997)激活細胞釋放c1q結合膜蛋白cC1qR和gC1qR。亞細胞定位和免疫化學表征。免疫學雜誌84:17-26。［Ref。］
22. Ghebrehiwet B, Cebada-Mora C, Tantral L, Jesty J, Peerschke EI (2006) gC1qR/p33是補體和接觸係統之間的分子橋梁，是炎症的重要催化劑。Adv Exp Med bio 586: 95-105。［Ref。］
23. Fogal V, Richardson AD, Karmali PP, Scheffler IE, Smith JW, et .(2010)線粒體p32蛋白通過維持氧化磷酸化是腫瘤代謝的重要調節因子。摩爾細胞生物學30:1303-1318。［Ref。］
24. 馮霞，Tonnesen MG, Peerschke EI, Ghebrehiwet B (2002) C1q受體和整合素在C1q介導的內皮細胞粘附和擴散中的協同作用。中華免疫學雜誌(免疫學版):356 - 361。［Ref。］
25. Rubinstein DB, Stortchevoi A, Boosalis M, Ashfaq R, Ghebrehiwet B, et al. (2004) C1q球狀頭受體(gC1q-R, p33，透明質酸結合蛋白)在腺癌細胞中優先表達。癌症雜誌110:741-750。［Ref。］
26. Dembitzer FR, Kinoshita Y, Burstein D, Phelps RG, Beasley MB，等(2012)gC1qR在正常和病理人類組織中的表達:上皮和間質來源組織中的差異表達。細胞化學雜誌60:467-474。［Ref。］
27. Prakash M, Kale S, Ghosh I, Kundu GC, Datta K(2011)透明質酸結合蛋白I (HBPI/p32/gC1qR)通過整合素α(v)β(3)相互作用，通過NF-kappa B依賴的MMP-2激活誘導黑素瘤細胞遷移和腫瘤生長。手機信號23:1563-1577。［Ref。］
28. 於光，王靜(2013)透明質酸結合蛋白(HABP1/P32/gC1qR)在晚期漿液性卵巢癌患者中的表達意義。Exp Mol Pathol 94: 210-215。［Ref。］
29. Ghebrehiwet B, Ji Y, Valentino A, Pednekar L, Ramadass M, et al.(2014)可溶性gC1qR是一種誘導內皮細胞B1R表達的自分泌信號。中華免疫學雜誌19(4):354 - 354。［Ref。］
30. Parenti A, Morbidelli L, Ledda F, Granger HJ, Ziche M(2001)緩激肽/B1受體通過一氧化氮合酶途徑上調內皮內源性FGF-2促進血管生成。Faseb j 15: 1487-1489。［Ref。］
31. Fogal V, Shang L, Krajewski S, Ruoslahti E(2008)線粒體/細胞表麵蛋白p32/gC1qR在腫瘤細胞和腫瘤間質中的分子靶向作用。巨蟹座Res 68: 7210-7218。［Ref。］
32. Sanchez-Martin D, Cuesta AM, Fogal V, Ruoslahti E, Alvarex-Vallina L(2011)多室區p32/gC1qR作為抗體腫瘤靶向策略的新靶點。生物化學雜誌286:5197-5203。［Ref。］
33. Ghosh I, Chowdhury AR, Rajeswari MR, Datta K(2004)透明質酸結合蛋白1 (HABP1)/P32/C1QBP在表皮癌進展中的差異表達。分子細胞生物化學267:133-139。［Ref。］
34. Chem YB，薑濤，尚國強，王建軍，龐東(2009)乳腺癌患者透明質酸結合蛋白1表達增高與預後不良相關。中華外科雜誌100:382-386。［Ref。］
35. 郭wx, Ghebrehiwet B, Weksler B, Schweitzer K, Peerschke EIB(1999)炎性細胞因子上調補體成分C1q內皮細胞結合蛋白/受體。中華檢驗雜誌臨床雜誌133:541-550。［Ref。］

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