癌症研究與分子機製

全文

研究文章
RNA幹擾介導的大腸癌化學致敏細胞係DKC1基因敲除

泰米停1拉赫曼賈馬爾1納-1、2萬祖瑞納萬納迦1、3Norfilza穆罕默德身1, 4 *

1UKM醫學分子生物學研究所,馬來西亞Kebangsaan大學,Jalan Ya 'acob Latiff, 56000 Cheras,馬來西亞吉隆坡
2馬來西亞Kebangsaan大學醫學院醫學係,馬來西亞吉隆坡50300
3.馬來西亞Kebangsaan大學醫學院生物化學係,馬來西亞吉隆坡50300
4馬來西亞Kebangsaan大學醫學院生理學係,馬來西亞吉隆坡50300

*通訊作者:Norfilza Mohd Mokhtar, UKM醫學分子生物學研究所,馬來西亞Kebangsaan大學,Jalan Ya 'acob Latiff,馬來西亞吉隆坡56000 Cheras,電話:006 03 91718459;傳真:006 003 91717185;電子郵件:norfilza@ppukm.ukm.edu.my


條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Ting T, Jamal R, Harun R, Wan Ngah WZ, Mokhtar NM(2015)化學致敏CRC細胞係中DKC1基因的RNA幹擾介導敲除。國際癌症Res Mol Mech 1(2): doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.106

版權:©2015 Ting T.這是一篇基於創作共用署名許可條款發布的開放獲取文章,該許可允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製,前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

  • 收到日期:2015年6月09

  • 接受日期:2015年6月24日

  • 發表日期:2015年6月27日
  • 摘要
    背景

    Dyskerin (DKC1)基因是一種tolemerase核糖核蛋白複合體,已被報道在各種散發性癌症中上調,包括結直腸癌(CRC)。本研究旨在探討其作為結直腸癌治療靶點的潛力。

    材料和方法

    采用RNA幹擾(RNAi)技術下調兩種人結直腸癌細胞係HCT116和HT- 29中DKC1的表達,然後用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理。進行了功能測定。采用定量聚合酶鏈反應(qPCR)和免疫印跡法(Western blotting)評價RNAi的療效。

    結果

    轉染後48小時和72小時,靶向DKC1的RNAi分別顯著降低了兩種細胞係的mRNA和蛋白水平,同時降低了細胞活力(P<0.05)。HCT116細胞在細胞周期的G1期被阻滯。沉默後的5-FU處理進一步降低了細胞活力,使HCT116細胞阻滯在G2期。RNAi處理也顯著減少了HCT116細胞的遷移。

    結論

    DKC1與5-FU聯合沉默可能是抑製結直腸癌生長的良好策略。

    關鍵字

    結直腸癌;RNA幹擾;5 -氟尿嘧啶;DKC1中蛋白質;細胞周期

    簡介

    Dyskerin是一種高度保守的蛋白質DKC1中真核生物[1]基因。它存在於小核仁核糖核蛋白顆粒中,已被證明對所有基本的細胞事件具有多效功能,如蛋白表達、細胞生長和細胞增殖[2]。Dyskerin是端粒酶核糖核蛋白複合體的重要組成部分,是端粒酶RNA組分穩定、端粒酶活性正常和端粒維持所必需的。它通過將核糖體RNA的特異性尿苷殘基轉化為假尿苷[2],在rRNA加工和正常核糖體生物發生中也必不可少。最近,它在內部核糖體進入位點(IRES)介導的翻譯中的作用也被報道。

    Dyskerin表達與活性細胞增殖[5]密切相關。在實驗條件下,其表達上調,促進細胞生長和增殖,並通過乳腺癌[6]和結腸癌[7]的致癌刺激。最近的研究也發現了DKC1中與肝細胞癌[8],口腔鱗癌[5]和前列腺癌[9]相關的基因自上規以來DKC1中基因與細胞增殖有關DKC1中基因可能成為癌症治療的潛在靶點

    自1957年以來,氟嘧啶類藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)被廣泛用於CRC的治療。其作用機製包括抑製胸苷酸合成酶,將其代謝產物並入RNA和DNA,並誘導細胞周期阻滯和凋亡[11]。然而,5-FU在結直腸癌(CRC)患者中的總體緩解率很低,並取決於DNA錯配修複狀態[12]。因此,迫切需要新的治療策略來提高該藥作為抗癌藥物的療效。

    RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是一種序列特異性的轉錄後基因沉默過程,廣泛存在於生物體中,由與靶向基因[13]序列同源的雙鏈RNA啟動。發掘…的潛力DKC1中作為一種新的治療靶點,我們應用了siRNA靶向DKC1中減少其表達,然後5-FU處理CRC細胞係。本研究的目的是確定siRNA和siRNA與5-FU聯合治療對腫瘤細胞化療敏感性的影響。

    材料和方法
    細胞係

    使用的人腺癌細胞株HT-29和HCT116 CRC細胞株購買於美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國類型培養收藏館。細胞在McCoy’s 5A培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中繁殖,並添加10%的胎牛血清(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

    小幹擾RNA (siRNA)轉染

    轉染前,對細胞進行胰蛋白酶化和計數。然後將細胞在無抗生素的培養基中稀釋至5 × 10的鍍液密度4細胞/ mL和100µL的細胞被鍍至96孔板的每孔中,孵育過夜。細胞轉染50 nM ON-TARGET + SMART pool siRNA靶向DKC1中(NM_001363)基因使用DharmaFECT轉染試劑(Dharmacon, Lafayette, CO, USA),並根據製造商的方案孵育兩天。以管家基因GAPDH為靶點的siRNA作為陽性對照。RNA誘導沉默複合體Free (RISC-free) siRNA作為陰性對照。然後使用功能分析評估siRNA沉默的影響。

    5 -氟尿嘧啶(研究者用)治療

    5-FU (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)溶解在100%二甲基亞碸(DMSO)中(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA),然後在培養基中稀釋。用不同濃度(0-200 M)的5-FU處理細胞24、48和72小時。對照組細胞是經過sirna處理但未使用藥物的細胞。5-FU的細胞毒作用通過獲得50%的抑製濃度(IC50:抑製藥物濃度,導致50%的細胞存活)值。siRNA處理的細胞株在1/10的IC中與5-FU進一步孵育50用於後續分析的濃度。

    細胞生存能力分析

    細胞滴度-熒光細胞活力測定法(Pr omega, Madison, WI, USA)用於測定siRNA轉染和細胞5-FU處理後的細胞活力。製備了含有培養基但不含細胞的對照孔,以獲得背景發光值。每孔100µl的含細胞培養基中加入100µl的試劑,製備96孔的不透明壁板。內容物在軌道搖床上混合兩分鍾以誘導細胞裂解。板在室溫下孵育10分鍾以穩定發光信號,然後使用Spectra Max L發光微板閱讀器(Molecular Devices, Sunnyvale, California, calif)在570 nm波長下測量發光信號。

    細胞遷移和侵襲試驗

    使用QCM™24孔比色細胞遷移檢測試劑盒(Millipore, Hamburg, Germany)評估細胞遷移,同時按照製造商說明使用QCM 24孔比色膠原細胞侵襲檢測試劑盒(Millipore, Hamburg, Germany)評估細胞侵襲。簡單地說,細胞(1 × 104)的無血清培養液鍍於上室,下室裝有化學引誘劑(10%胎牛血清)培養液。培養48小時後,用棉簽去除非侵入性細胞。通過膜遷移並粘附在膜下表麵的細胞被染色和提取。為了定量,在560 nm處用Varioskan Flash微板閱讀器(Thermo Scientific, Waltham)檢測入侵細胞。試驗在三份中進行。

    細胞周期分析

    根據製造商的說明,使用Cycle TEST PLUS DNA試劑試劑盒(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)處理細胞。處理48小時後,將細胞懸液置於17 × 100-mm管中。試管離心,吸氣,收集細胞,洗滌,並懸浮在1ml緩衝溶液中。DNA倍性分析的染色程序需要5.0 × 105細胞。細胞懸液以400x g離心5分鍾。所有上清均取下。然後加入250µL的胰蛋白酶緩衝液孵育10分鍾,再加入200µL的胰蛋白酶抑製劑和RNase緩衝液,室溫孵育10分鍾。加入200 uL冷碘化丙啶染色液,在黑暗中冰上孵育10分鍾。樣品經35 μ m細胞過濾蓋過濾至12 × 75-mm管中。使用FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)流式細胞法測定DNA含量。使用Mod fit細胞周期分析軟件(verityhouse Software, Topsham, ME, USA)分析數據。

    siRNA敲除的驗證

    根據製造商的協議,使用轉子-基因RG-6000實時熱循環儀(Corbett Research,悉尼,澳大利亞),利用Solaris人類qPCR基因表達測定法(Thermo Scientific, Waltham),在mRNA水平上通過qPCR檢測DKC1基因沉默的效率。正向引物和反向引物的序列DKC1中分別為5 ' -GGACTATATCAGGACAGGTTTC-3 '和5 ' -GAAGTATCCGTCGAATCCAG-3 '。該基因的探針序列為TTCCCATGAGGTGGTAGCC。sirna靶向基因的表達歸一化為-actin (ACTB)。在所有轉染實驗中,∆CT表達歸一化到未處理的樣品[14]。

    為了確保RNAi在蛋白質水平上的有效性,轉染後72小時進行Western blot。使用RIPA緩衝液收集細胞裂解物,其中含有25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1%去氧膽酸鈉,0.1% SD和完整的蛋白酶抑製劑雞尾酒(Thermo Scientific)。使用含有相當於30 μg蛋白質的裂解物,並按照常規方案進行Western blot分析。簡單地說,蛋白質通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在12%凝膠上分離,然後轉移到PVDF膜上。使用的抗體和稀釋劑包括抗dkc1(1:100稀釋,Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)和抗-肌動蛋白(1:200稀釋,Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。經過廣泛清洗後,將膜與辣根過氧化物酶結合的小鼠抗兔抗體(1:5 000稀釋,Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)在室溫下孵育一小時,並根據製造商協議使用Super Signal West Pico化學發光襯底(Pierce/Thermo Fisher Scientific Rockford, IL)進行培養。使用柯達Bio Max光膜(Care stream Health, Woodbridge, CT)曝光膜進行化學發光帶檢測。

    統計分析

    使用Microsoft Excel 2007 (Microsoft, Redmond, WA)對處理和未處理樣品的平均值進行雙尾Student 's t檢驗進行統計分析,P值<0.05認為結果顯著。

    結果
    抗DKC1的RNAi下調了RNA和蛋白的表達

    無risc siRNA轉染細胞和單純轉染試劑轉染細胞的靶基因mRNA水平無顯著差異。轉染後48小時,敲除DKC1中基因的mRNA水平明顯低於未處理的細胞,其中% knockdown (KD)的DKC1中HT-29細胞為88.6%,HCT116細胞為77.3%(n = 6P<0.05)(圖1A和圖1b)。”

    Western blot結果證實兩種細胞係中DKC1蛋白的減少(n=3,如圖2所示)。

    沉默DKC1可增加HCT116細胞對5-FU的敏感性

    5-FU的細胞毒作用通過獲得50%的抑製濃度(IC50).的集成電路50與5-FU孵育48小時的HCT116細胞的µM為100 μ M (n=6個,圖3A),而IC50與5-FU孵育72小時的HT-29細胞的µM為200 μ (n=6,圖3B)。為了確定RNAi和5-FU對HCT116細胞增殖的影響,我們轉染細胞DKC1中siRNA, 10µm5 - fu處理。擊倒的DKC1中與未處理的細胞相比,48h後細胞活力下降(n=6, P<0.05)。5-FU處理後細胞活力進一步下降(n=6, P<0.05;圖4)。

    細胞活力也有類似的下降DKC1中HT-29細胞轉染48h後出現敲除(n=6, P<0.05)。然而,RNAi後的5-FU處理並沒有導致HT-29細胞活力的顯著降低(n =6,圖4B)。

    沉默DKC1減少細胞遷移

    RNAi靶向後HCT116細胞遷移減少55.9±10% (P<0.05)DKC1中,與對照細胞相比(各n=6,圖5),而靶向DKC1的RNAi在轉染48小時後對HT-29細胞無影響(各n=6,圖5)。敲除DKC1基因也顯示兩種細胞係在細胞侵襲方麵無顯著差異(各n=6,數據未顯示)。

    沉默DKC1使HCT116細胞阻滯於細胞周期的G1期

    對於HCT116細胞,敲除DKC1中轉染48小時後,G1期細胞比例(66±3.4%)(P<0.05)高於對照組細胞(57.2±3.3%)(n=6個,圖6A)。沉默後的5-FU處理DKC1中HCT116細胞在G2期阻滯(48.3±1.7%),而對照細胞(32.7±4.7%)(n=6,圖6B),而HT-29細胞不受敲除或5-FU進一步處理(n=6,數據未顯示)的影響。

    討論

    siRNA技術已被應用於開發癌症的新療法。對於這項研究,我們假設使用RNAi對抗DKC1中基因和5-FU可以減少化療藥物的劑量,這些藥物以使人衰弱的副作用而聞名。我們成功地證明了使用siRNA技術抑製特定分子靶標功能的有效性,並研究了其下遊效應在體外

    圖1:的抑製直方圖DKC1中HT- 29 (A)和HCT116 (B)細胞mRNA表達DKC1中核轉染。他的基因DKC1中歸一化到內參基因,即-肌動蛋白(ACTB)。以GAPDH作為陽性對照,確認siRNA沉默的特異性。數據顯示為平均值±SD來自三個獨立的實驗P < 0.01與未處理細胞和無RNA誘導沉默複合體(RISC-free)細胞相比。

    圖2:Western blot分析HT-29和HCT116細胞中DKC1蛋白的表達。lane(1)未轉染的細胞和lane(2)抗DKC1的siRNA使用等量的總蛋白,用抗DKC1和ACTB (beta actin)抗體檢測的相同印跡作為對照。

    圖3:折線圖顯示5-氟尿嘧啶(5-FU)對HCT116 (A)和HT-29 (B)細胞的生長抑製作用。分別用0、6.25、12.5、25、50、100和200 μ M 5-FU處理細胞24、48和72 h,采用細胞滴度-熒光法測定細胞活力。用IC法評價5-FU的細胞毒性作用50.使HCT116細胞存活率達到50%的藥物濃度為100 μ M,而IC50與5-FU孵育72小時的HT-29細胞,為200 μ M。數據顯示為三個獨立實驗的平均值,每個實驗進行三次重複;酒吧, SD。

    圖4:直方圖顯示siRNA和5-FU聯合處理對HCT116和HT-29細胞的生長抑製作用(A)。這些細胞被轉染DKC1中siRNA培養48小時,添加或不添加5-FU,使用Cell TiterGlo熒光法測定活力。轉染無risc siRNA的細胞作為陰性對照。敲除蛋白48h後,細胞活力明顯下降DKC1中基因後進行5-FU處理,與未處理細胞相比。列表示為三個獨立實驗的平均值,每個實驗進行三次重複;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

    圖5:DKC1 siRNA對HCT116和HT-29細胞遷移影響的直方圖。RNAi靶向後HCT116細胞遷移明顯減少(P<0.05)DKC1中,與對照細胞相比,當RNAi靶向DKC1中轉染48小時後對HT-29細胞無影響。列表示為三個獨立實驗的平均值,每個實驗進行三次重複;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

    圖6:直方圖顯示的效果DKC1中HCT116細胞周期上的siRNA在沒有(A)或存在(B) 5-FU的情況下。細胞轉染siRNA 48手,然後在添加或不添加5-FU的情況下培養。(一)擊倒DKC1中轉染48 h後HCT116細胞G1期百分率顯著高於對照組(P<0.05)。(B)沉默後的5-FU處理DKC1中與對照組相比,抑製HCT116細胞在G2期。列被提出作為三個獨立的實驗的手段,每個在三次重複中執行;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

    的潛力DKC1中作為一個治療靶點被展示出來DKC1中轉染48小時後抑製HCT116和HT-29細胞活力。得到的結果與先前的研究報告的表達一致DKC1中與細胞增殖速率[5]相關。The critical function of DKC in colon cancer cells is more likely to rely in protein biosynthesis which mainly affects the cell viability and proliferation [5]. Our study showed a reduced percentage of cell migration in the HCT116 cells following the silencing ofDKC1中基因。然而,抑製DKC1中對HT-29細胞係的細胞遷移沒有顯著影響。

    觀察到的不同效果可能是由於細胞係具有不同的突變。對於HT-29, p53基因的密碼子273發生G -> a突變,導致Arg -> His取代,而HCT116細胞出現野生型細胞係[15]。TP53[16]是一種腫瘤抑製基因,可維持基因組完整性,誘導受損細胞無法修複的凋亡。HT-29細胞在BRAF而HCT116細胞在喀斯特基因。這兩個基因是ras - raf -絲裂原激活蛋白激酶通路中的原癌基因,傳遞促增殖信號[15]。此外,HCT116細胞來源於低分化的原發性結腸癌,具有微衛星不穩定性,這使得它們容易在整個基因組[17]中積累突變。相反,HT-29細胞來源於一種具有微衛星穩定特征[17]的中分化結腸癌。基因特征的不同可能導致對化療藥物(如5-FU)的敏感性反應不同。

    我們的研究表明,通過RNAi沉默DKC1導致HCT116細胞的化學敏感性增強,從而進一步降低細胞活力。5-FU已在臨床上使用超過30年,已知其作用於增殖細胞通過幹擾DNA合成[11]。此外,5-FU誘導細胞周期阻滯[18,19]。

    我們還證明了5-FU治療是否DKC1中沉默導致HCT116細胞分別積聚在G2期和S期。對於HT-29細胞,RNAi靶向DKC1中5-FU處理和陰性對照均誘導細胞周期S期的相對細胞數顯著增加。這些發現與之前的研究一致,5-FU是一種S相活性的化療藥物,當細胞處於G中時,5-FU沒有活性0或G1[20]。5-FU處理會導致DNA損傷,特別是在S期由於FdUTP誤入DNA[21]而導致雙鏈(和單鏈)斷裂。然而,在增殖細胞中,DNA的損傷可以發生在細胞周期的所有階段,而涉及的修複機製在細胞周期的不同階段有所不同[22]。5-FU對DNA合成的抑製表現在S期,5-FU摻入RNA發生在G1期[23]。根據先前的報道,5-FU的DNA或rna導向的細胞毒性會導致人結腸癌細胞中早期S期細胞的消失或G1/S期細胞的積累[23,24]。我們發現,與單獨使用5-FU處理的細胞相比,RNAi和5-FU處理的細胞在細胞周期阻滯方麵沒有顯著差異。這表明5-FU單獨治療能夠誘導CRC細胞的細胞周期調節發生顯著變化。

    總之,沉默DKC1中有可能與5-FU聯合使用,進一步降低HCT116細胞和HT29細胞的活力。

    確認

    本研究得到了馬來西亞高等教育部高等教育卓越中心(HiCoE)的資助。


    參考文獻
    1. Heiss NS, Knight SW, Vulliamy TJ, Klauck SM, Wiemann S等人(1998)x連鎖先天性角化不良是由一種推測具有核仁功能的高度保守基因突變引起的。Nat Genet 19: 32-38。[Ref。
    2. 蒙塔納羅L (2010) Dyskerin與癌症:大於端粒酶。mRNA翻譯中的缺陷有助於解釋增殖缺陷如何導致癌症。中華病理學雜誌22:345-349。[Ref。
    3. Mochizuki Y, He J, Kulkarni S, Bessler M, Mason PJ(2004)小鼠dyskerin突變影響端粒酶RNA和小核仁RNA的積累、端粒酶活性和核糖體RNA加工。美國科學院學報101:10756-10761。[Ref。
    4. Rocchi L, Pacilli A, Sethi R, Penzo M, Schneider RJ等(2013)Dyskerin缺失增加VEGF mRNA內部核糖體入口位點介導的轉譯。核酸Res 41: 8308-8318。[Ref。
    5. Alawi F, Lin P, Ziober B, Patel R (2011) dyskerin表達與獨立於端粒酶的活性增殖的相關性。頭頸33:1041-1051。[Ref。
    6. Montanaro L, Calienni M, Ceccarelli C, Santini D, Taffurelli M,等。(2008)人乳腺癌中dyskerin表達與端粒酶活性的關係。細胞腫瘤30:483-490。[Ref。
    7. Witkowska A, Gumprecht J, Glogowska-Ligus J, Wystrychowski G, Owczarek A,等(2010)結腸癌中重要永生基因的表達譜。中華醫學雜誌25:321-329。[Ref。
    8. 劉斌,張娟,黃超,劉宏(2012)人肝細胞癌Dyskerin過表達與臨床分期晚期和患者預後不良相關。PLoS One 7: e43147。[Ref。
    9. Sieron P, Hader C, Hatina J, agers R, Wlazlinski A,等(2009)DKC1過表達與前列腺癌進展相關。癌症雜誌101:1410-1416。[Ref。
    10. Mariadason JM, Tebbutt NC(2011)結腸癌中5-FU反應的生物標誌物。癌症生物學雜誌11:771-772。[Ref。
    11. Chua W, Kho PS, Moore MM, Charles KA, Clarke SJ(2011)預測結直腸癌化療療效和毒性的臨床、實驗室和分子因素。血壓計血壓計79:224-250。[Ref。
    12. Jover R, Zapater P, Castells A, Llor X, Andreu M等(2009)結直腸癌5-氟尿嘧啶輔助化療的療效取決於錯配修複狀態。巨蟹座雜誌45:365- 373。[Ref。
    13. Grosshans H, Filipowicz W(2008)分子生物學:小rna的擴展世界。自然451:414 - 416。[Ref。
    14. Livak KJ, Schmittgen TD(2001)使用實時定量PCR和2 (-Delta Delta C(T))方法分析相關基因表達數據。方法25:402 - 408。[Ref。
    15. Ahmed D, Eide PW, Eilertsen IA, Danielsen SA, Eknaes M, et al.(2013) 24株結腸癌細胞係的表觀遺傳學和遺傳特征。瘤形成2:e71。[Ref。
    16. Toledo F, Wahl GM(2006)調節p53途徑:體外假設,體內事實。癌症6:909-923。[Ref。
    17. Duldulao MP, Lee W, Le M, Chen Z, Li W,等(2012)微衛星穩定型和不穩定型結腸癌細胞的基因表達變化。中華外科雜誌第174期:1-6。[Ref。
    18. Longley DB, Harkin DP, Johnston PG(2003) 5-氟尿嘧啶的作用機製和臨床策略。巨蟹座3:33 - 338。
    19. Filgueiras Mde C, Morrot A, Soares PM, Costa ML, Mermelstein C(2013) 5-氟尿嘧啶對平滑肌細胞原代培養中核和細胞形態、增殖、細胞周期、凋亡、細胞骨架和小泡分布的影響。PLoS One 8: e63177。[Ref。
    20. De Angelis PM, Svendsrud DH, Kravik KL, Stokke T(2006) 5-氟尿嘧啶耐藥結腸癌細胞株在治療和恢複過程中對5-氟尿嘧啶的細胞應答。摩爾癌症5:20。[Ref。
    21. Wilson PM, Fazzone W, LaBonte MJ, Deng J, Neamati N,等。(2008)胸苷酸代謝作為治療靶點的新機會。Mol Cancer Ther 7: 3029-3037。
    22. 王曉東,王曉東,王曉東(2004)。細胞周期檢查點與癌症。自然432:316 - 323。[Ref。
    23. Mojardin L, Botet J, Quintales L, Moreno S, Salas M(2013)抗癌藥物5 ' -氟尿嘧啶在真核細胞中基於rna的作用機製的新見解。PLoS One 8: e78172。[Ref。
    24. 郭霞,Goessl E, Jin G, Collie-Duguid ES, Cassidy J,等(2008)細胞周期擾動與獲得性5-氟尿嘧啶化學耐藥。抗癌文獻28:9-14。[Ref。

    在此下載臨時pdf

    PDF