條信息

Aritcle類型:研究文章

引用:Ting T, Jamal R, Harun R, Wan Ngah WZ, Mokhtar NM(2015)化學致敏CRC細胞係中DKC1基因的RNA幹擾介導敲除。國際癌症Res Mol Mech 1(2): doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-3318.106

版權:©2015 Ting T.這是一篇基於創作共用署名許可條款發布的開放獲取文章，該許可允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2015年6月09

接受日期:2015年6月24日

發表日期:2015年6月27日

摘要

背景

Dyskerin (DKC1)基因是一種tolemerase核糖核蛋白複合體，已被報道在各種散發性癌症中上調，包括結直腸癌(CRC)。本研究旨在探討其作為結直腸癌治療靶點的潛力。

材料和方法

采用RNA幹擾(RNAi)技術下調兩種人結直腸癌細胞係HCT116和HT- 29中DKC1的表達，然後用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理。進行了功能測定。采用定量聚合酶鏈反應(qPCR)和免疫印跡法(Western blotting)評價RNAi的療效。

結果

轉染後48小時和72小時，靶向DKC1的RNAi分別顯著降低了兩種細胞係的mRNA和蛋白水平，同時降低了細胞活力(P<0.05)。HCT116細胞在細胞周期的G1期被阻滯。沉默後的5-FU處理進一步降低了細胞活力，使HCT116細胞阻滯在G2期。RNAi處理也顯著減少了HCT116細胞的遷移。

結論

DKC1與5-FU聯合沉默可能是抑製結直腸癌生長的良好策略。

關鍵字

結直腸癌;RNA幹擾;5 -氟尿嘧啶;DKC1中蛋白質;細胞周期

簡介

Dyskerin是一種高度保守的蛋白質DKC1中真核生物[1]基因。它存在於小核仁核糖核蛋白顆粒中，已被證明對所有基本的細胞事件具有多效功能，如蛋白表達、細胞生長和細胞增殖[2]。Dyskerin是端粒酶核糖核蛋白複合體的重要組成部分，是端粒酶RNA組分穩定、端粒酶活性正常和端粒維持所必需的。它通過將核糖體RNA的特異性尿苷殘基轉化為假尿苷[2]，在rRNA加工和正常核糖體生物發生中也必不可少。最近，它在內部核糖體進入位點(IRES)介導的翻譯中的作用也被報道。

Dyskerin表達與活性細胞增殖[5]密切相關。在實驗條件下，其表達上調，促進細胞生長和增殖，並通過乳腺癌[6]和結腸癌[7]的致癌刺激。最近的研究也發現了DKC1中與肝細胞癌[8]，口腔鱗癌[5]和前列腺癌[9]相關的基因自上規以來DKC1中基因與細胞增殖有關DKC1中基因可能成為癌症治療的潛在靶點

自1957年以來，氟嘧啶類藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)被廣泛用於CRC的治療。其作用機製包括抑製胸苷酸合成酶，將其代謝產物並入RNA和DNA，並誘導細胞周期阻滯和凋亡[11]。然而，5-FU在結直腸癌(CRC)患者中的總體緩解率很低，並取決於DNA錯配修複狀態[12]。因此，迫切需要新的治療策略來提高該藥作為抗癌藥物的療效。

RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是一種序列特異性的轉錄後基因沉默過程，廣泛存在於生物體中，由與靶向基因[13]序列同源的雙鏈RNA啟動。發掘…的潛力DKC1中作為一種新的治療靶點，我們應用了siRNA靶向DKC1中減少其表達，然後5-FU處理CRC細胞係。本研究的目的是確定siRNA和siRNA與5-FU聯合治療對腫瘤細胞化療敏感性的影響。

材料和方法

細胞係

使用的人腺癌細胞株HT-29和HCT116 CRC細胞株購買於美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國類型培養收藏館。細胞在McCoy’s 5A培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中繁殖，並添加10%的胎牛血清(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。

小幹擾RNA (siRNA)轉染

轉染前，對細胞進行胰蛋白酶化和計數。然後將細胞在無抗生素的培養基中稀釋至5 × 10的鍍液密度⁴細胞/ mL和100µL的細胞被鍍至96孔板的每孔中，孵育過夜。細胞轉染50 nM ON-TARGET + SMART pool siRNA靶向DKC1中(NM_001363)基因使用DharmaFECT轉染試劑(Dharmacon, Lafayette, CO, USA)，並根據製造商的方案孵育兩天。以管家基因GAPDH為靶點的siRNA作為陽性對照。RNA誘導沉默複合體Free (RISC-free) siRNA作為陰性對照。然後使用功能分析評估siRNA沉默的影響。

5 -氟尿嘧啶(研究者用)治療

5-FU (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)溶解在100%二甲基亞碸(DMSO)中(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)，然後在培養基中稀釋。用不同濃度(0-200 M)的5-FU處理細胞24、48和72小時。對照組細胞是經過sirna處理但未使用藥物的細胞。5-FU的細胞毒作用通過獲得50%的抑製濃度(IC₅₀:抑製藥物濃度，導致50%的細胞存活)值。siRNA處理的細胞株在1/10的IC中與5-FU進一步孵育₅₀用於後續分析的濃度。

細胞生存能力分析

細胞滴度-熒光細胞活力測定法(Pr omega, Madison, WI, USA)用於測定siRNA轉染和細胞5-FU處理後的細胞活力。製備了含有培養基但不含細胞的對照孔，以獲得背景發光值。每孔100µl的含細胞培養基中加入100µl的試劑，製備96孔的不透明壁板。內容物在軌道搖床上混合兩分鍾以誘導細胞裂解。板在室溫下孵育10分鍾以穩定發光信號，然後使用Spectra Max L發光微板閱讀器(Molecular Devices, Sunnyvale, California, calif)在570 nm波長下測量發光信號。

細胞遷移和侵襲試驗

使用QCM™24孔比色細胞遷移檢測試劑盒(Millipore, Hamburg, Germany)評估細胞遷移，同時按照製造商說明使用QCM 24孔比色膠原細胞侵襲檢測試劑盒(Millipore, Hamburg, Germany)評估細胞侵襲。簡單地說，細胞(1 × 10⁴)的無血清培養液鍍於上室，下室裝有化學引誘劑(10%胎牛血清)培養液。培養48小時後，用棉簽去除非侵入性細胞。通過膜遷移並粘附在膜下表麵的細胞被染色和提取。為了定量，在560 nm處用Varioskan Flash微板閱讀器(Thermo Scientific, Waltham)檢測入侵細胞。試驗在三份中進行。

細胞周期分析

根據製造商的說明，使用Cycle TEST PLUS DNA試劑試劑盒(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)處理細胞。處理48小時後，將細胞懸液置於17 × 100-mm管中。試管離心，吸氣，收集細胞，洗滌，並懸浮在1ml緩衝溶液中。DNA倍性分析的染色程序需要5.0 × 10⁵細胞。細胞懸液以400x g離心5分鍾。所有上清均取下。然後加入250µL的胰蛋白酶緩衝液孵育10分鍾，再加入200µL的胰蛋白酶抑製劑和RNase緩衝液，室溫孵育10分鍾。加入200 uL冷碘化丙啶染色液，在黑暗中冰上孵育10分鍾。樣品經35 μ m細胞過濾蓋過濾至12 × 75-mm管中。使用FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)流式細胞法測定DNA含量。使用Mod fit細胞周期分析軟件(verityhouse Software, Topsham, ME, USA)分析數據。

siRNA敲除的驗證

根據製造商的協議，使用轉子-基因RG-6000實時熱循環儀(Corbett Research，悉尼，澳大利亞)，利用Solaris人類qPCR基因表達測定法(Thermo Scientific, Waltham)，在mRNA水平上通過qPCR檢測DKC1基因沉默的效率。正向引物和反向引物的序列DKC1中分別為5 ' -GGACTATATCAGGACAGGTTTC-3 '和5 ' -GAAGTATCCGTCGAATCCAG-3 '。該基因的探針序列為TTCCCATGAGGTGGTAGCC。sirna靶向基因的表達歸一化為-actin (ACTB)。在所有轉染實驗中，∆C_T表達歸一化到未處理的樣品[14]。

為了確保RNAi在蛋白質水平上的有效性，轉染後72小時進行Western blot。使用RIPA緩衝液收集細胞裂解物，其中含有25 mM Tris-HCl (pH 7.6)， 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1%去氧膽酸鈉，0.1% SD和完整的蛋白酶抑製劑雞尾酒(Thermo Scientific)。使用含有相當於30 μg蛋白質的裂解物，並按照常規方案進行Western blot分析。簡單地說，蛋白質通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在12%凝膠上分離，然後轉移到PVDF膜上。使用的抗體和稀釋劑包括抗dkc1(1:100稀釋，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)和抗-肌動蛋白(1:200稀釋，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)。經過廣泛清洗後，將膜與辣根過氧化物酶結合的小鼠抗兔抗體(1:5 000稀釋，Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)在室溫下孵育一小時，並根據製造商協議使用Super Signal West Pico化學發光襯底(Pierce/Thermo Fisher Scientific Rockford, IL)進行培養。使用柯達Bio Max光膜(Care stream Health, Woodbridge, CT)曝光膜進行化學發光帶檢測。

統計分析

使用Microsoft Excel 2007 (Microsoft, Redmond, WA)對處理和未處理樣品的平均值進行雙尾Student 's t檢驗進行統計分析，P值<0.05認為結果顯著。

結果

抗DKC1的RNAi下調了RNA和蛋白的表達

無risc siRNA轉染細胞和單純轉染試劑轉染細胞的靶基因mRNA水平無顯著差異。轉染後48小時，敲除DKC1中基因的mRNA水平明顯低於未處理的細胞，其中% knockdown (KD)的DKC1中HT-29細胞為88.6%，HCT116細胞為77.3%(n = 6P<0.05)(圖1A和圖1b)。”

Western blot結果證實兩種細胞係中DKC1蛋白的減少(n=3，如圖2所示)。

沉默DKC1可增加HCT116細胞對5-FU的敏感性

5-FU的細胞毒作用通過獲得50%的抑製濃度(IC₅₀)．的集成電路₅₀與5-FU孵育48小時的HCT116細胞的µM為100 μ M (n=6個，圖3A)，而IC₅₀與5-FU孵育72小時的HT-29細胞的µM為200 μ (n=6，圖3B)。為了確定RNAi和5-FU對HCT116細胞增殖的影響，我們轉染細胞DKC1中siRNA, 10µm5 - fu處理。擊倒的DKC1中與未處理的細胞相比，48h後細胞活力下降(n=6, P<0.05)。5-FU處理後細胞活力進一步下降(n=6, P<0.05;圖4)。

細胞活力也有類似的下降DKC1中HT-29細胞轉染48h後出現敲除(n=6, P<0.05)。然而，RNAi後的5-FU處理並沒有導致HT-29細胞活力的顯著降低(n =6，圖4B)。

沉默DKC1減少細胞遷移

RNAi靶向後HCT116細胞遷移減少55.9±10% (P<0.05)DKC1中，與對照細胞相比(各n=6，圖5)，而靶向DKC1的RNAi在轉染48小時後對HT-29細胞無影響(各n=6，圖5)。敲除DKC1基因也顯示兩種細胞係在細胞侵襲方麵無顯著差異(各n=6，數據未顯示)。

沉默DKC1使HCT116細胞阻滯於細胞周期的G1期

對於HCT116細胞，敲除DKC1中轉染48小時後，G1期細胞比例(66±3.4%)(P<0.05)高於對照組細胞(57.2±3.3%)(n=6個，圖6A)。沉默後的5-FU處理DKC1中HCT116細胞在G2期阻滯(48.3±1.7%)，而對照細胞(32.7±4.7%)(n=6，圖6B)，而HT-29細胞不受敲除或5-FU進一步處理(n=6，數據未顯示)的影響。

討論

siRNA技術已被應用於開發癌症的新療法。對於這項研究，我們假設使用RNAi對抗DKC1中基因和5-FU可以減少化療藥物的劑量，這些藥物以使人衰弱的副作用而聞名。我們成功地證明了使用siRNA技術抑製特定分子靶標功能的有效性，並研究了其下遊效應在體外．

圖1:的抑製直方圖DKC1中HT- 29 (A)和HCT116 (B)細胞mRNA表達DKC1中核轉染。他的基因DKC1中歸一化到內參基因，即-肌動蛋白(ACTB)。以GAPDH作為陽性對照，確認siRNA沉默的特異性。數據顯示為平均值±SD來自三個獨立的實驗P < 0.01與未處理細胞和無RNA誘導沉默複合體(RISC-free)細胞相比。

圖2:Western blot分析HT-29和HCT116細胞中DKC1蛋白的表達。lane(1)未轉染的細胞和lane(2)抗DKC1的siRNA使用等量的總蛋白，用抗DKC1和ACTB (beta actin)抗體檢測的相同印跡作為對照。

圖3:折線圖顯示5-氟尿嘧啶(5-FU)對HCT116 (A)和HT-29 (B)細胞的生長抑製作用。分別用0、6.25、12.5、25、50、100和200 μ M 5-FU處理細胞24、48和72 h，采用細胞滴度-熒光法測定細胞活力。用IC法評價5-FU的細胞毒性作用₅₀．使HCT116細胞存活率達到50%的藥物濃度為100 μ M，而IC₅₀與5-FU孵育72小時的HT-29細胞，為200 μ M。數據顯示為三個獨立實驗的平均值，每個實驗進行三次重複;酒吧, SD。

圖4:直方圖顯示siRNA和5-FU聯合處理對HCT116和HT-29細胞的生長抑製作用(A)。這些細胞被轉染DKC1中siRNA培養48小時，添加或不添加5-FU，使用Cell TiterGlo熒光法測定活力。轉染無risc siRNA的細胞作為陰性對照。敲除蛋白48h後，細胞活力明顯下降DKC1中基因後進行5-FU處理，與未處理細胞相比。列表示為三個獨立實驗的平均值，每個實驗進行三次重複;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

圖5:DKC1 siRNA對HCT116和HT-29細胞遷移影響的直方圖。RNAi靶向後HCT116細胞遷移明顯減少(P<0.05)DKC1中，與對照細胞相比，當RNAi靶向DKC1中轉染48小時後對HT-29細胞無影響。列表示為三個獨立實驗的平均值，每個實驗進行三次重複;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

圖6:直方圖顯示的效果DKC1中HCT116細胞周期上的siRNA在沒有(A)或存在(B) 5-FU的情況下。細胞轉染siRNA 48手，然後在添加或不添加5-FU的情況下培養。(一)擊倒DKC1中轉染48 h後HCT116細胞G1期百分率顯著高於對照組(P<0.05)。(B)沉默後的5-FU處理DKC1中與對照組相比，抑製HCT116細胞在G2期。列被提出作為三個獨立的實驗的手段，每個在三次重複中執行;酒吧、SD。*P<0.05與對照細胞比較。

的潛力DKC1中作為一個治療靶點被展示出來DKC1中轉染48小時後抑製HCT116和HT-29細胞活力。得到的結果與先前的研究報告的表達一致DKC1中與細胞增殖速率[5]相關。The critical function of DKC in colon cancer cells is more likely to rely in protein biosynthesis which mainly affects the cell viability and proliferation [5]. Our study showed a reduced percentage of cell migration in the HCT116 cells following the silencing ofDKC1中基因。然而,抑製DKC1中對HT-29細胞係的細胞遷移沒有顯著影響。

觀察到的不同效果可能是由於細胞係具有不同的突變。對於HT-29, p53基因的密碼子273發生G -> a突變，導致Arg -> His取代，而HCT116細胞出現野生型細胞係[15]。TP53[16]是一種腫瘤抑製基因，可維持基因組完整性，誘導受損細胞無法修複的凋亡。HT-29細胞在BRAF而HCT116細胞在喀斯特基因。這兩個基因是ras - raf -絲裂原激活蛋白激酶通路中的原癌基因，傳遞促增殖信號[15]。此外，HCT116細胞來源於低分化的原發性結腸癌，具有微衛星不穩定性，這使得它們容易在整個基因組[17]中積累突變。相反，HT-29細胞來源於一種具有微衛星穩定特征[17]的中分化結腸癌。基因特征的不同可能導致對化療藥物(如5-FU)的敏感性反應不同。

我們的研究表明，通過RNAi沉默DKC1導致HCT116細胞的化學敏感性增強，從而進一步降低細胞活力。5-FU已在臨床上使用超過30年，已知其作用於增殖細胞通過幹擾DNA合成[11]。此外，5-FU誘導細胞周期阻滯[18,19]。

我們還證明了5-FU治療是否DKC1中沉默導致HCT116細胞分別積聚在G2期和S期。對於HT-29細胞，RNAi靶向DKC1中5-FU處理和陰性對照均誘導細胞周期S期的相對細胞數顯著增加。這些發現與之前的研究一致，5-FU是一種S相活性的化療藥物，當細胞處於G中時，5-FU沒有活性₀或G₁[20]。5-FU處理會導致DNA損傷，特別是在S期由於FdUTP誤入DNA[21]而導致雙鏈(和單鏈)斷裂。然而，在增殖細胞中，DNA的損傷可以發生在細胞周期的所有階段，而涉及的修複機製在細胞周期的不同階段有所不同[22]。5-FU對DNA合成的抑製表現在S期，5-FU摻入RNA發生在G1期[23]。根據先前的報道，5-FU的DNA或rna導向的細胞毒性會導致人結腸癌細胞中早期S期細胞的消失或G1/S期細胞的積累[23,24]。我們發現，與單獨使用5-FU處理的細胞相比，RNAi和5-FU處理的細胞在細胞周期阻滯方麵沒有顯著差異。這表明5-FU單獨治療能夠誘導CRC細胞的細胞周期調節發生顯著變化。

總之，沉默DKC1中有可能與5-FU聯合使用，進一步降低HCT116細胞和HT29細胞的活力。

確認

本研究得到了馬來西亞高等教育部高等教育卓越中心(HiCoE)的資助。

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