文摘

遺傳操縱腫瘤細胞通過細胞內的質粒DNA (pDNA)和short-interfering RNA (siRNA)將是一個有吸引力的方法有效地治療各種癌症以最小的不利影響。然而,裸DNA或核被核酸酶迅速降解,展品低細胞吸收與合成可憐的轉染效率。最近的研究一直致力於開發智能納米顆粒高效的轉基因產品運輸和siRNAs變成癌細胞。兩個可溶性鹽之間的反應導致降水的不溶性鹽顆粒的形式已經成為一個很好的方法來製造生物相容性人們在基因治療中潛在的應用。在這裏,我們報告的發展基於不溶性鹽鋇納米粒子吸附帶負電荷的質粒DNA的能力和核與有效攜帶手機進入人類(MCF-7)和小鼠乳腺癌細胞係(4 t1)。特別是,硫酸鋇,鋇亞硫酸鹽和氟化鋇納米顆粒核酸很強的親和力,有效的細胞吸收和高轉基因表達細胞係細胞毒性較低。與納米顆粒細胞內的核目標MAPK MAPK的沉默基因尤其是MCF-7引起,導致抑製的表達和激活MAPK和AKT,兩個關鍵信號分子PI-3和MAPK激酶途徑,分別。此外,nanoparticles-facilitated運輸p53基因導入MCF-7和4 t1細胞導致顯著的細胞死亡的類型取決於鋇鹽粒子用來攜帶質粒DNA。因此,鋇鹽納米粒子已成為一個有吸引力的人們有巨大前景高效細胞內核酸交付acidbased療法來治療乳腺癌。

關鍵字

乳腺癌;藥物輸送;納米顆粒;MAPK;p53;細胞毒性;鋇硫酸鹽;鋇亞硫酸鹽和氟化鋇

介紹

應用治療基因和siRNAs極大增加了由於他們在臨床醫學的巨大潛力。基因治療涉及治療基因的傳遞,使其感興趣的轉錄和翻譯成蛋白質,或核酸序列沉默一個特定基因的表達,在一個特定的細胞類型。遺傳操縱人類細胞通過運輸等功能基因的質粒DNA (pDNA)和核是一個有吸引力的方法來治療許多關鍵基因和後天的疾病有單個或多個基因缺陷[1]。然而,裸體治療基因和siRNAs迅速退化和低效細胞吸收差的轉染活性和gene-knockdown有效性,分別。因此發展理想的基因載體是基本成功的基因治療可接受的安全概要[2]。

密集的努力在過去四十年的發展導致了大量的核酸交付車輛,一般分為病毒和病毒性向量[3]。雖然病毒載體是高度有效地克服多個細胞外和細胞內的障礙通常觀察到在交付過程中,他們擁有關鍵的限製包括免疫原性、致癌性和DNA承載能力低,這限製了它們在臨床醫學的應用[4]。相反,病毒性載體,如陽離子脂質、聚合物、脂類和縮氨酸,和無機納米粒子是相對安全的,但具有局限性的物理穩定性差,由網狀內皮係統血液快速清關,低細胞內化,低效endosomal逃避和窮人核易位(5、6)。提高病毒性載體的轉染效率是至關重要的成功在未來基因治療。

無機納米粒子構成病毒性向量的一個重要分支。與有機同行不同,無機向量證明一些獨特的特性,如——定義粒子尺寸,穩定性,獨特的磁性和電特性。無機納米粒子定向運輸目標細胞的核酸專注於臨床前研究金、二氧化矽、碳酸磷灰石、碳納米管、量子點和鐵氧化物[7]。然而,大部分的無機納米粒子當前正在研究的是不能生物降解,提高大擔憂他們的臨床意義。此外,表麵改性通常需要防止其selfaggregation和使他們能夠與核酸相互作用,表麵塗層代理或cell-recognizable配體(14 - 17)。沉澱反應是一種納米級無機材料合成的新方法,利用許多獨特而有趣的物理和化學性質的不溶性鹽。它涉及兩個可溶性鹽反應物之間的反應在水溶液中形成一種不溶性鹽產品通過誘導超飽和(18、19)。生成的鹽nano-precipitates要求參與簡單的設備和提供靈活地控製粒子的大小和成分接近環境溫度和壓力。最近的發展有利的結果顯示從納米顆粒準備降水方法,包括碳酸鈣(CaCO)₃),鐵氧化物(鐵₃O₄)和硫酸鋇(BaSO4) [20]。

鋇化合物在醫學領域與許多應用程序相關聯。不可溶性鋇化合物大多無毒,讓他們用於臨床和藥用化妝品領域[23]。貝索₄例如,低毒性和高不透明度為x射線成像作為電台造影劑消化道。高溶解度的鋇鹽在酸性環境也可能幫助釋放pDNA和核的粒子成核內體,因此促進後續步驟的處理目標內源性基因的轉基因表達和沉默,分別[22]。在這項研究中,納米晶體形成的各種配方已經測試了鋇吸附pDNA和阻止他們潛在的能力,這些核酸運輸到4 t1和MCF-7細胞,促進目標蛋白表達的沉默後細胞內交付MAPK siRNA和誘導細胞毒性後交付MAPK核和p53基因在乳腺癌細胞。

材料和方法

試劑

氯化鋇(BaCl₂)、硫酸鈉(Na₂所以₄)、亞硫酸鈉(Na₂所以₃),氟化鈉(氟化鈉)、碳酸鈉(Na₂有限公司₃)、磷酸鈉(Na₂HPO₄),4 - (2-hydroxyethyl)——1-piperazineethanesulfonic酸(玫瑰),溴化乙錠(EtBr)和Propidium碘(π)獲得Sigma-Aldrich(密蘇裏州,美國)。杜爾貝科的修改鷹介質(DMEM)從Gibco BRL購買(美國田納西州)。質粒pGL3(美國Promega)含SV40下啟動子熒光素酶基因和質粒pEGFP-N1含有綠色熒光蛋白(pGFP)基因提取DH5α細菌菌株大腸杆菌(大腸杆菌)試劑盒質粒提取工具包(希爾登,德國)。房顫488 -核(熒光核從試劑盒,收購德國。

細胞培養

MCF-7和4 t1細胞培養在75厘米²燒瓶與10%胎牛血清的DMEM補充(的邊後衛)(西格瑪奧德裏奇,美國),10%的玫瑰和50µg青黴素ml-1 37°C濕潤5%股份有限公司₂——包含大氣。細胞接近90% confluency時,接種了胰蛋白酶化後分離細胞的貼壁細胞和澆注適當數量的新板塊有10% serum-supplemented DMEM。

加工和篩選潛在的鋇鹽晶體

每種類型的鋇鹽粒子是由合並5µl 1 M的陽離子-提供氯化鋇鹽10µl HEPES-buffered解決方案(pH值調整到7.5)和混合解決方案5µl 1 M的一個anion-providing鹽、Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄。最後的混合物是孵化為30分鍾37°C和隨後添加到10% FBS-supplemented DMEM培養基獲得1毫升的最終體積粒子懸浮。在320納米波長吸光度測量所有的鋇鹽和碳酸磷灰石(有限公司₃美聯社)粒子spectrophotometrically(1800紫外分光光度計、日本島津公司、日本)。公司的準備₃美聯社納米粒子溶解外生CaCl涉及₂在5毫米1毫升bicarbonate-buffered DMEM (pH值7.4)和孵化為30分鍾37°C,其次是增加10%的邊後衛,生成的CO₃AP粒子,以防止進一步增長或粒子的聚合。光度測量在一式三份和數據與平均數±標準差繪製成圖。

操縱反應鹽生成納米粒子的濃度是通過添加BaCl執行的₂從2µl 10µl 1米到消息靈通的緩衝溶液與後續混合5µl 1 m Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄合成解決方案和孵化30分鍾37°C。時間分析粒子的形成是由添加5µl BaCl 1米₂10µl HEPES-buffered媒體(pH值7.5)和混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄在37°C,然後孵化0,30和60分鍾和隨後的混合serum-supplemented DMEM。pH值對粒子形成的影響進行了分析通過製備HEPES-buffered各種小靈通的解決方案從4到9和5µl 1 M BaCl混合₂2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄在孵化前解決方案為30分鍾37°C。孵化溫度變化的影響,探討了通過孵化30分鍾在不同溫度(4°C, 37°C和70°C)混合後生成的鹽晶體5µl BaCl 1米₂和2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄消息靈通的緩衝區的一個固定的pH值(7.4),孵化時間。有限公司₃美聯社是包含在每個實驗作為積極的控製。實驗研究了在圖一式三份和分析提出了平均數±標準差。

大小估計和NPs電動電勢測量

製造納米粒子的大小和電動電勢測量利用ζ篩選器(英國莫爾文、納米z)進行混合後5µl 1 M氯化鋇和2µl 10µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂阿寶₄在一個消息靈通的緩衝區,其次是孵化在37°C 30分鍾。生成的鹽晶體保持在冰前與Zetasizer測量。折射指數(RI)比例為1.325(由折射計測量DMEM媒體)是用來計算粒子大小和電動電勢。分析的數據進行了使用Zetasizer軟件6.20和所有鹽樣品重複測量和顯示為平均數±標準差。各種納米晶體的大小和形態樣本可視化通過場發射掃描電子顯微鏡(日本日立s - 4700 FE-SEM)。納米顆粒在15000轉離心10秒鍾,其次是移除上層清液和再懸浮milli - Q水。鹽顆粒懸浮液被保持在冰前顯微觀察。1µl每個樣本被放置到碳tapecoated樣品架和在室溫下幹燥,緊隨其後的是濺射鉑幹樣品的30秒。氣急敗壞的納米顆粒的顯微觀察是通過使用FE-SEM在10 - 15千伏。

pDNA和核粒子的親和力

一項研究涉及親和力pDNA和核向各種鋇鹽粒子包括定性和定量測量的fluorescence-labeled pDNA和核與粒子。1µg pDNA (pGFP)與碘化propidium共價標記(π)1:1比例和添加到5µl BaCl 1米₂在10µl HEPES-buffered解決方案,其次是整合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄到解決方案生成各自攜帶熒光pDNA鹽沉澱,通過孵化37°C 30分鍾。DMEM培養基添加到表單的最後一卷1毫升粒子懸浮。有限公司₃AP粒子(積極控製)在pGFP:π的比例1按照相同程序如上所述。聚合粒子的微觀可視化是實現以下的捏造鹽晶體的每個好24-well板(Nunc、丹麥),熒光顯微鏡下,觀察(奧林巴斯、日本)。定量測量nanoparticles-bound pDNA涉及多標記板閱讀的上層清液代表遊離DNA的一部分(Victor X5,珀金埃爾默),離心分離後的不同製定粒子在15000 RPM 5分鍾。100年µl上層清液吸氣,轉移到96孔板(Nunc、丹麥),之前熒光強度測量。

親和力的核粒子後確定包含100海裏房顫488 -控製核(熒光核、試劑盒、德國)5µl BaCl 1米₂和隨後的10µl HEPES-buffered連同2µl 1 M Na的解決方案₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄孵化之前,37°C 30分鍾。每個實驗做了一式三份和平均數±標準差和分析。

細胞吸收的粒子綁定pDNA和核

MCF-7細胞指數增長階段被播種在50000細胞/到24-well盤子轉染的前一天。細胞吸收particle-bound核研究了引入10 nM的房顫488 siRNA(試劑盒、德國)5µl BaCl 1米₂,其次是混合10µl消息靈通的緩衝區和2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄在37°C,孵化30分鍾形成particle-siRNA複合物。DMEM媒體添加到沉澱形成1毫升最終粒子懸浮的體積。10%的邊後衛終於添加到懸架。鹽顆粒的每種類型與播種癌細胞孵化了4小時,粒子懸浮,刪除之前洗的細胞與10毫米EDTA在PBS和另外100µl serum-supplemented媒介。

細胞毒性測定粒子的影響

細胞毒性的鋇鹽粒子是由細胞生存能力試驗(MTT),孵化後治療細胞24小時到72小時不等。5µl BaCl 1米₂與2µl混合1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄沒有核酸在10µl HEPES-buffered解決方案。在37°C, 30分鍾孵化後生成的粒子受到MCF-7和4 t1細胞1 - 3天,與有限公司₃美聯社納米粒子作為一個控製。可行的細胞的分數是決定使用MTT試驗。短暫,50µL MTT (PBS 5毫克/毫升)添加了無菌細胞治療的每一個水井,其次是孵化在37°C和5%有限公司₂4小時。介質包含麻省理工後吸氣潛伏期和甲瓚晶體形成底部的每個被添加溶解300µL二甲亞碸(DMSO)解決方案。吸光度的甲瓚的解決方案是確定spectrophotometrically在595 nm波長使用標(丹尼克斯Opsys先生,美國),參照630海裏。

基因表達和沉默效果的評價在體外

1毫升懸掛的每種類型的鹽顆粒含有pGFP或熒光素酶記者向量(pGL3)或p53 gene-carrying質粒,並配以DMEM媒體,被引入每個與大約50000 MCF-7或4 t1細胞在前一天播種。1µg pGFP pGL3或p53與5µl 1 M BaCl混合₂之前的2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄生成相應的鹽沉澱在10µl消息靈通的解決方案通過孵化為30分鍾37°C。Serum-supplemented DMEM培養基添加實現1毫升的鹽懸浮液。有限公司₃美聯社準備後添加外源性CaCl pDNA和5毫米₂準備1毫升DMEM媒體,孵化為30分鍾在37°C,添加10%的邊後衛前懸掛。細胞治療各種配方連續一段4小時前刪除particle-containing媒體和簡要洗治療細胞10毫米的EDTA 1 x PBS。在替換1毫升血清DMEM媒體,這些細胞被培養48小時,觀察之前通過熒光顯微鏡(pGFP)和熒光素酶基因表達記者化驗(pGL3)使用商業套裝(美國Promega)和光子計數(美國貝克曼庫爾特)。定量熒光素酶試驗重複三次,表示在圖的意思是±SD發光活動/毫克的蛋白質。

p53基因表達對細胞生存的影響評估增加50µl MTT(5毫克/毫升1 x PBS)解決細胞治療第一次4小時p53 plasmid-bound粒子,用5毫米EDTA在PBS和進一步孵化新鮮血清中48小時。中包含麻省理工是吸氣後4小時孵化,甲瓚形成晶體在每個混合溶解的300µl DMSO溶液。中包含裸體siRNA代表負控製研究。定量測定甲瓚晶體的光學密度的形式(OD)在595 nm波長參照630海裏使用微型板塊分光光度計(美國Bio-Rad)。

檢查擊倒的內源性基因的影響和表達/激活水平的相關信號分子細胞內後交付使用各種鋇鹽特定核的粒子,10 nM MAPK siRNA引入5µl BaCl 1米₂,緊隨其後的是整合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄在10µl消息靈通的媒體,和孵化為30分鍾37°C。Serum-supplemented DMEM媒體被用於粒子懸浮1毫升。MAPK siRNA-loaded有限公司₃美聯社(積極控製)是由外生CaCl MAPK siRNA和5毫米₂1毫升的DMEM培養基和孵化37°C 30分鍾。最後,10%的邊後衛,添加到懸架。細胞治療在第一個4小時,其次是媒介,與EDTA清洗PBS和替換1毫升血清- DMEM培養基補充。隨後孵化了48小時,之前添加50µl MTT細胞在每個形成甲瓚晶體通過新陳代謝活躍的細胞。中包含MTT吸氣後4小時孵化與甲瓚形成晶體在每個混合溶解的300µl DMSO的解決方案。小幹擾rna(無鹽)中隻包含代表消極的控製研究。定量測定甲瓚晶體OD的形式是在595 nm波長參照630海裏使用微型板塊分光光度計(美國Biorad)。siRNA-loaded粒子的細胞生存能力和裸核(NPs)計算基於方程:

\[細胞\ % {\ rm {}} {\ rm{}}可行性:{\ rm{}} \壓裂{{OD {\ rm {}} {\ rm {}} nc加載{\ rm {}}, {\ rm {}} OD參考{\ rm {}}}} {{OD裸體{\ rm {}} {\ rm {}} siRNA {\ rm {}}, {\ rm {}} OD參考{\ rm {}}}} \ * {\ rm {}} 100 \]

每個實驗進行了一式三份,並表示在圖的意思是±SD的細胞生存能力。

細胞對MAPK-siRNA自由和particle-bound形式(貝索₄,貝索₃和BaF₂)分別與IP裂解緩衝和受到細胞溶解在13000轉離心20分鍾在4°C。上層清液組成蛋白質樣本收集和5µl吸氣估計蛋白質的總量在牛血清白蛋白(BSA)試驗設備基於手冊。在最初的一步,BSA蛋白用於創建標準曲線,這是用來計算的總蛋白濃度細胞溶解產物基於他們的吸收強度。剩餘的樣本整除並存儲在-80°C為後續sds - page及免疫印跡。總蛋白的細胞溶解產物含有30µg混合10µl 10 x加載染料和受到SDSPAGE使用染色免費迷你蛋白質SFX凝膠(15井)在運行緩衝液1 x 0.01安培/凝膠。7µl精度+蛋白質standards-dual顏色作為分子量標記建立樣本的蛋白質的分子量。蛋白質樣品從凝膠轉移到0.2µm PVDF膜附著trans-blot渦輪通過trans-blot渦輪增壓傳輸係統傳輸包了7分鍾1.3安培,其次是阻塞在5%脫脂奶1 x TBST室溫1小時。膜下孵化主要抗體(pMAPK、TMAPK pAKT,節拍和GAPDH加載引用)在4°C一夜溫柔顫抖,隨後在1 x TBST洗5次去除的主要抗體。HRP-conjugated山羊anti-rabbit二級抗體Ig G(1:3000)被引入膜與溫和的風潮,1小時前洗了5次1 x TBST再次消除遊離抗體。發射極耦合邏輯的混合膜被暴露在5分鍾之前的觀察樂隊通過化學發光信號使用XRS Chemidoc係統(美國BioRad)。

結果和討論

代鹽沉澱

直接混合BaCl₂與鈉₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄在37°C,其次是孵化30分鍾導致顯微鏡下可見的微粒。粒子的形成通常是伴隨著增長和粒子的聚合,提供急劇增加,吸光度在320 nm的反映濁度(圖1)和展示大-大小的晶體在光學顯微鏡(圖1 b)。pH值的優化,反應物的濃度、時間和溫度孵化因此至關重要的製造有效的納米顆粒。粒子形成加速隨著反應物的濃度增加,因此作為驅動力的化學反應[24](圖1)。

圖1:濁度測量和光學顯微圖像的鋇鹽粒子。(一)吸光度沉澱反應形成的顆粒強度。添加5µl 1 M氯化鋇,10µl消息靈通的緩衝媒體(pH值調整為7.5),其次是混合5µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄,生成各種鹽晶體在30分鍾孵化在37°C。隨後,serum-supplemented DMEM媒體添加實現1毫升粒子懸浮。在320納米波長吸光度測量所有的粒子與參考公司使用分光光度計₃美聯社。(B)顯微觀察的粒子形成的沉澱反應。捕獲圖像分辨率10 x,參照(f)有限公司₃美聯社。

調查基於濁度測定的反應物濃度的影響(圖2)和光學顯微圖像(圖2 b)表明,粒子配方2毫米的鋇鹽表現出減少粒子的增長和更少的聚合與更為集中鹽相比,表明粒子成長取決於反應物的濃度在時間和孵化溫度和pH值是固定的。如圖2所示,BaCl cation-providing鹽的增加₂(從2µl 10µl 1米)與一個常數(5µl 1米)的anion-providing鹽、Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄沉澱反應的速率,增強與吸光度或濁度增加的結果。同樣,合成粒子的速度加快,增加濃度(2µl 10µl 1米)anion-providing鹽(Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄)固定濃度的BaCl的存在₂(cation-providing鹽)(圖2 b)。航母的核酸綁定效率是由粒子大小和數目,和可用的指控,這在過量可能會導致生成巨大的聚集,防止最佳DNAparticle複合物的形成和阻礙細胞吸收的複合物[25](圖2)。

圖2:(一)cation-providing鹽濃度對顆粒形成的影響。不同濃度的(a) BaCl₂介紹了(2µl、5µl和10µl 1米)到10µl消息靈通的緩衝媒體(pH值7.5),其次是混合5µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄,生成各種鹽粒子在30分鍾孵化在37°C。(B) anion-providing鹽濃度對顆粒形成的影響。5µl BaCl 1米₂被引入10µl消息靈通的緩衝媒體(pH值調整為7.5),其次是混合不同濃度的鈉₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄(2µl、5µl和10µl 1米),生成各種鹽粒子在30分鍾孵化在37°C。隨後,FBS-containing DMEM媒體添加到實現最終卷1毫升粒子懸浮。吸光度在320海裏所有的粒子使用分光光度計測量參考有限公司₃美聯社。

增量的pH值、溫度、培養時間變化反應平衡向正向增強電離和反應物的擴散。如圖3所示,粒子的形成是增強固定的反應物濃度下(5μl BaCl 1米₂和2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄)隻是通過增加潛伏期(A),消息靈通的緩衝區的pH值(B)和(C)孵化溫度,由於增加的能量水平,因此提高反應的速率(26、27)(圖3)。

圖3:(一)培養時間對粒子形成的影響。5µl 1 M (a) BaCl₂被引入10μl消息靈通的緩衝介質pH值(7.5),其次是混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄,生成各種鹽晶體在孵化在37°C在不同時間點(0,30和60分鍾)。(B) pH值調整粒子形成的影響。5µl 1 M (a) BaCl₂被引入10µl消息靈通的緩衝媒體(pH值從4.5 - -9.5),其次是混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄孵化,生成各種鹽晶體在30分鍾在37°C。(C)孵化溫度對粒子形成的影響。5µl 1 M (a)氯化鋇引入10µl消息靈通的緩衝介質pH值(7.5),其次是混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄孵化,生成各種鹽晶體在30分鍾在37°C。隨後,媒體的邊後衛containing-DMEM是添加到實現最終卷1毫升粒子懸浮。吸光度在320納米測量所有的粒子,參照有限公司₃美聯社。

更高的粒子的生成速率通常會導致更大的顆粒大小(28、29)。濁度分析表明,貝索₄和貝索₃具有粒子的增長最快,而BaF2和BaCO₃有關增長最慢(圖2 b)。確認粒子增長伴隨著形成更大的粒子,我們估計的平均直徑由Zetasizer每種類型的粒子。如表1所示,貝索₄和貝索₃形成與顆粒直徑比公司更大的嗎₃AP粒子,而BaF₂和BaCO₃被發現是相對小的尺寸。電動電勢估計更消極的粒子形成cation-providing (10 nM)濃度較高的鹽。選擇的粒子(貝索的圖像₃和BaF₂)被掃描電子顯微鏡(SEM)也提供了證據表明,大貝索₃粒子是聚合的結果更小的粒子,而小BaF₂粒子的形成是伴隨著低聚合(圖4和表1)。

圖4:掃描電鏡的可視化BaSO3和BaF2粒子。BaSO3和BaF2粒子生成根據協議中描述的方法和材料部分在15000轉離心10秒鍾,緊隨其後的是浮在表麵的去除和再懸浮的pelette milli-Q 1毫升的水。捏造的鹽晶體微觀觀察之前被保存在冰。1µl resuspended解決方案是放置到碳tape-coated樣品架和在室溫下幹燥,緊隨其後的是鉑金的每種類型的晶體樣品濺射60秒。氣急敗壞的樣本觀察到aprroximately 10 - 15千伏。

鹽配方	anion-providing鹽的濃度	大小(d.nm)	澤塔(mV)
貝索4	2毫米	734±41	8
	10毫米	1974±32	-10年
貝索3	2毫米	506±19	-11年
	10毫米	1418±33	-20年
BaF2	2毫米	218±29	6
	10毫米	345±28	-15年
BaCO3	2毫米	243±18	-12年
	10毫米	315±52	-16年
英航3(PO4)2	2毫米	345±61	-15年
	10毫米	344±49	-16年
公司美聯社3	- - - - - -	321±51	-10年

表1:鋇鹽粒子的粒徑和電動電勢。捏造的粒子進行了分析使用Zetasizer獲取平均尺寸和表麵電荷的每種類型的晶體,參照有限公司₃美聯社。

濁度和顆粒直徑的結果表明,鹽是由鋇的沉澱反應的類型和濃度的可溶性鹽、鋇孵化溫度、時間和最後,反應混合物的pH值,以生成一個過飽和溶液中,導致粒子成核和發展到成熟晶體大小不同的。鋇硫酸鹽和亞硫酸鹽鋇表現出更高的數量和大尺寸的粒子與其他鹽相比。粒子與預計20 - 200 nm直徑有良好的腫瘤積累能力,利用破血管和腫瘤的淋巴引流係統。更高的循環時間導致小粒子大小可能會進一步加強粒子積聚在腫瘤站點(27、28)。隨後,粒子直徑< 100海裏最適合運輸基因材料通過內吞作用進入細胞[30]。表麵負電荷從6到-20 mV被顯示為各種不溶性鹽鋇。ζ電位,電位的粒子,粒子穩定和表麵形態相關[25]。然而,表麵電荷測量並不意味著內在電荷存在粒子,因為環境包含不同離子的水溶液可以顯著影響電動電勢。Cation-providing鋇鹽(BaCl₂)的粒子可以創建陰離子結合域,使粒子綁定帶負電荷的核酸。

綁定的親和力pDNA和核鋇鹽粒子

親和力的DNA鋇鹽晶體是評估通過標簽pGFPπ,熒光染料,形成各種鋇鹽粒子存在pDNA的標簽。粒子的熒光圖像24-well板顯示強烈的熒光主要聚合粒子發出貝索₄和貝索₃以及小和聚合粒子的BaF(圖5)。間接定量分析基於自由(釋放)估計PI-labeled質粒存在於上層清液(離心後各種鋇鹽粒子)(圖5 b)表明,貝索₄,貝索₃,BaF和CO3AP pDNA顯著高親和力,而BaCO₃或英航₃(PO₄2)擁有更少的親和力。類似的發現是觀察到的相同的間接定量分析利用fluorescence-labeled核(圖5)。缺乏明亮的熒光顯微圖像的π- plasmid-loaded有限公司₃美聯社(5)可能是由於存在的微小粒子發射微弱熒光的相對較小。pDNA綁定到一個粒子(圖5)。

圖5:(一)熒光顯微觀察pDNA向鋇鹽粒子的親和力。5µl 1 M (a) BaCl₂介紹了隨著PI-stained pDNA(1:1比例)到10µl消息靈通的緩衝媒體,其次是混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₂HPO₄和孵化為30分鍾37°C。FBScontaining DMEM媒體添加實現1毫升的解決方案。圖片拍攝於10倍分辨率下π過濾器,參照二氧化碳。(B)熒光分析的親和力pDNA對存在的粒子製定PI-labeled DNA同樣如上所述。(C)親和力的核粒子的熒光分析。5µl 1 M (a) BaCl₂介紹了隨著房顫488核10µl消息靈通的緩衝媒體,其次是混合2µl 1 M Na₂所以₄,Na₂所以₃氟化鈉,鈉₂有限公司₃或Na₃阿寶₄和孵化為30分鍾37°C。定量測量particles-bound pDNA /核,多標記板實現了讀者在15000 RPM製造顆粒的離心後5分鍾和100年願望µl為96板,之前熒光強度測量。

fluorescence-labeled核酸的細胞吸收

細胞的核酸acid-nanoparticle複合物通常受到DNA粒子的親和力和平均粒徑[29]。較小的內化——大小的顆粒細胞被證明是增長了20倍相比,索取的[31]。熒光顯微觀察後4小時孵化MCF-7細胞的熒光siRNA-loaded鋇鹽粒子顯示大量的核與細胞膜或細胞內化的貝索₄,貝索₃和BaF₂粒子,而沒有明顯的熒光信號為BaCO可視化₃或英航₃(PO₄)₂粒子(圖6)。BaCO非常微弱的熒光信號₃或英航₃(PO₄)₂粒子可能是由於低親和力的核酸,如圖5所示,盡管他們的規模相對較小的貝索相比₄和貝索₃粒子。盡管是大尺寸,貝索的強烈信號₄和貝索₃粒子的概念可以解釋這些粒子與加載siRNAs主要定位在質膜而不是有效內化通過內吞作用(圖6)。

圖6:熒光顯微圖像的細胞吸收與房顫488 siRNA-loaded粒子MCF-7細胞。不同siRNA-loaded顆粒複合物轉入細胞播種在24-well 50000在每個板塊的前一天學習,其次是孵化為4小時。圖像捕獲與EDTA清洗PBS。

細胞毒性的鋇鹽粒子

nanocarrier臨床應用的先決條件之一是,它應該是無毒的人類細胞。我們已經測試了所有不同形式的鋇鹽粒子MCF-7和4 t1細胞在三個不同的時間點(24、48和72小時),孵化後的顆粒細胞。如圖7和圖8,所有類型的粒子,即貝索₄,貝索₃,BaF₂和BaCO₃粒子除了英航₃(PO₄)₂顯示出類似的細胞毒性的概要文件的有限公司₃美聯社,這表明它們是相對安全的航空公司。英航的原因更高的細胞毒性₃(PO₄)₂粒子尚未被理解(圖7和8)。

圖7:細胞毒性的鋇鹽粒子MCF-7細胞。50000 MCF-7細胞被播種,處理粒子和孵化24到72小時,與媒體替換前4小時後孵化。隨後,50µl MTT被納入治療細胞和介質包含麻省理工是吸氣後4小時孵化。300µl DMSO溶液溶解甲瓚晶體。與參考光譜光度測量的閱讀是在595 nm波長630納米。每個鹽類型分別與有限公司₃美聯社。

圖8:鋇鹽粒子4 t1細胞的細胞毒性。50000 MCF-7細胞被播種,處理粒子和孵化24到72小時,與媒體替換前4小時後孵化。隨後,50µl MTT被納入治療細胞和介質包含麻省理工是吸氣後4小時孵化。300µl DMSO溶液溶解甲瓚晶體。與參考光譜光度測量的閱讀是在595 nm波長630納米。每個鹽類型分別與有限公司₃美聯社。

轉基因表達鋇鹽粒子的活動

高親和力與後續有效的細胞核酸吸收不保證,將充分表達的轉基因細胞或核能夠沉默目標mRNA。轉基因表達或可拆卸的內源性基因的質粒或核必須釋放粒子和核內體內吞作用後,此外,質粒,它需要運送到細胞核表達。記者基因表達是間接的,但強大的方法來確認一個核酸釋放粒子和核內體,最後轉移到核膜。如圖9所示,盡管BaCO₃和英航₃(PO₄)₂粒子並沒有顯示任何活動在MCF-7細胞GFP的表達中,貝索₄,貝索₃和BaF₂粒子像有限公司₃AP粒子極大地導致了轉基因的表達,這可能是有關不僅為BaCO低親和力的DNA₃和英航₃(PO₄)₂粒子,但也可能低酸細胞吸收後這兩個粒子的溶解度。類似的研究結果發現MCF-7和4 t1細胞轉染後使用熒光素酶質粒(pGL3)的幫助下鋇鹽粒子(圖9和圖10)。

圖9:熒光顯微圖像MCF-7 GFP表達轉染後的細胞與pGFP-loaded鋇鹽粒子。pGFP-loaded粒子貝索₄,貝索₃,BaF₂,BaCO₃和英航₃(PO₄)₂、裸pGFP和pGFP-loaded有限公司₃美聯社是用來使轉染MCF-7細胞被播種在24-well 50000在每個板塊的前一天轉染實驗。細胞隨後被孵化為4小時,洗10毫米的EDTA 1 x PBS,緊隨其後的是2^nd孵化一段48小時,熒光顯微鏡下觀察。

圖10:轉染MCF-7和4 t1細胞熒光素酶plasmidloaded鋇鹽粒子。pGL3-loaded粒子貝索₄,貝索₃,BaF₂,BaCO₃和英航₃(PO₄)₂、裸pGFP和pGFP-loaded二氧化碳美聯社被用來使轉染MCF-7和4 t1細胞被播種在24-well 50000在每個板塊的前一天轉染實驗。細胞隨後被孵化為4小時,洗10毫米的EDTA 1 x PBS,緊隨其後的是2^nd孵化一段48小時。轉染細胞後,細胞溶解的媒體,其次是離心的溶解產物在4°C 15000 RPM 10分鍾。100年µl上層清液吸氣了估計的相對發光活動/毫克的蛋白質使用商業套裝和光子計數。

Intracelllular交付p53的質粒和MAPK siRNA使用選定的鋇鹽粒子

基於effiacy轉基因表達水平和理想的顆粒大小,我們選擇了兩個鋇鹽粒子,貝索₃和BaF₂進一步調查他們潛在的角色在誘導細胞毒性通過促進細胞內p53蛋白質粒和MAPK siRNA交付。p53與潛在能力是一個著名的腫瘤抑製逮捕和殺死癌細胞,而MAPK MAPK / ERK途徑的關鍵酶負責保證擴散的癌細胞,因此,沉默的小幹擾rna可以顯著抑製MAPK表達與特定的不受控製的細胞分裂。如圖11所示,細胞內交付使用BaF p53質粒₂和貝索₃粒子引起顯著的細胞毒性在MCF-7 (A)和4 t1細胞(B)與相應的粒子。特別是,BaF₂介導的基因導致毒性最高的兩種細胞係,表明BaF₂納米粒子也使轉基因表達最高的兩個細胞係(圖10)將成為一個強大的工具在交付genebased療法。另一方麵,貝索₃粒子被發現比BaF更有效率₂導致細胞死亡在MCF-7 (C)和4 t1 (D)細胞通過胞內交付MAPK siRNA,暗示貝索₃粒子和MAPK siRNA可能表現為協同作用導致明顯的細胞毒性。細胞內交付和p53基因的表達比交付和更具挑戰性沉默MAPK活性siRNA因為沉默目標信使rna在細胞溶質發生的轉基因表達需要核易位的質粒DNA在核,隨後啟動轉錄,翻譯在細胞質中。鋇鹽粒子像其他類型的交付向量,例如,有限公司₃美聯社可以通過離子與陰離子結合細胞膜用陽離子鹽組件(Ba的交互^{2 +}),導致內吞作用和隨後的退化在低酸性endosomal博士因此,DNA或核可能釋放,endosomal逃脫根據“proton-sponge”假說(10,14)(Figure11)。

圖11:細胞毒性結果後引入p53與貝索質粒₃和BaF₂粒子。MCF-7細胞的可行性(A)和(B) 4 t1細胞治療後p53-loaded鋇鹽粒子複合物。5毫米BaCl₂500年混合µg p53 2毫米Na合並之前₂所以₃或氟化鈉10µl消息靈通的解決方案。細胞的可行性(C) MCF-7和(D) 4 t1細胞治療後與MAPK siRNA-loaded鋇鹽粒子複合物。5毫米BaCl₂混合10 nM MAPK siRNAs 2毫米Na合並之前₂所以₃或氟化鈉10µl消息靈通的解決方案。每組實驗包括未經處理的細胞,有限公司₃美聯社和卸載鹽粒子作為控製。核酸acid-loaded粒子都被轉移到每個24-well板包含的乳腺癌細胞播種在50000個細胞/前一天。細胞培養48小時後更換particle-containing媒體serum-supplemented媒體前4 hr孵化後存在的各種粒子和後續治療5毫米EDTA在PBS。最後,50µl MTT被納入治療的細胞,和媒體包含麻省理工後吸氣4 hr孵化。300年µl DMSO溶液添加到溶解甲瓚晶體。可行的細胞的光譜光度測量的閱讀是在595 nm波長參照630海裏。

分析激活MAPK和AKT通路在細胞內的小幹擾rna與選定MAPK鋇鹽粒子

因為MAPK和AKT通路是扮演著關鍵的角色在癌症細胞增殖和生存,分別和兩個途徑可以彼此相互,我們已經調查這兩個通路的激活水平後細胞內交付MAPK siRNA貝索的幫助下₄,貝索₃和BaF₂粒子。如圖12所示,BaF₂粒子能夠擊倒MAPK和AKT,導致抑製MCF-7細胞磷酸化在極大程度上,這是類似於沉默的結果有限公司₃AP粒子。BaF的高容量₂粒子在siRNA-mediated擊倒與小直徑、高親和力的核酸,有效的細胞吸收和p53和MAPK siRNA介導細胞毒性增強。貝索的相對較低的可拆卸的功效₄比貝索₃可能是由於前者的大直徑,從而阻礙核的細胞吸收。4 t1細胞的整體較低的可拆卸的活動可能是由於快速增長的細胞與相對較低的結果,吸收siRNA-loaded粒子的細胞(圖12)。

圖12:MAPK蛋白表達後治療MCF-7和4 t1細胞MAPK siRNA-loaded選擇鋇鹽粒子。蛋白質從細胞溶解產物的處理獲得運行SDSPAGE和轉移到PVDF膜,其次是孵化主要抗體在兔子長大對phospho-p44/42 MAPK, p42/42 MAPK, phospho-Akt (Ser473)和一種蛋白激酶(pan)。HRPconjugated山羊anti-rabbit二級抗體被用來檢測化學發光信號。pMAPK預測區間,TMAPK pAkt和節拍44歲,分別為42歲和60 kDa。GAPDH作為加載標記與樂隊達到37 kDa。

結論

鋇鹽中粒子,BaF₂是最潛在nanocarrier提供質粒DNA和核為乳腺癌細胞,部分由於其體積小,核酸強大的親和力,有效的細胞進入和能力釋放核酸從粒子和核內體,從而使要麼沉默目標信使rna與特定的核或把pDNA為後續細胞核轉錄。兩個BaF₂和貝索₃粒子在交付了高潛力p53基因和MAPK siRNA誘導乳腺癌細胞死亡。據我們所知,這是第一個報告有效的細胞內核酸BaF的幫助下₂和貝索₃納米粒子。操縱的鋇鹽配方添加配體可能會改善他們的功效核酸交付。一個臨床前研究乳腺癌動物模型的基礎上進一步探索鋪平道路的潛力鋇鹽粒子核酸療法的靜脈注射。

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文章類型:研究文章

引用:Bakhtiar對於A Kamaruzman倪Othman, Zaini, Chowdhury嗯(2017)細胞內交付p53基因和MAPK siRNA乳腺癌細胞利用鋇鹽納米顆粒。J乳腺癌Res副詞1 (1):doi 3527.101 http://dx.doi.org/10.16966/2638

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出版的曆史:

收到日期:2017年9月29日

接受日期:2017年10月20日

發表日期:2017年10月26日