摘要

作品簡介:不相容A抗原在O型血受試者惡性細胞中的表達已在多項研究中被報道。雖然在10-20%的O型血患者中觀察到這種現象，但導致不相容A抗原表達的遺傳機製仍不清楚。

材料和方法:從腫瘤中已經表現出不相容A表達的7例患者對應的22個乳腺蠟塊中提取的基因組DNA作為模板土著居民的用熒光雙相SSP-PCR進行基因分型。采用下一代測序(NGS)技術對ABO血型基因外顯子6和7進行測序。

結果:4/7例為正常DNA和腫瘤DNA O/O基因型，3/7例為正常DNA O/O基因型和腫瘤DNA A/O基因型。新的移碼突變320delA在等位基因o的第6外顯子上產生了終止密碼子。在3/7表達不兼容A抗原的腫瘤組織中，刪除320，產生的終止密碼子不再存在，閱讀框不改變，從而合成了糖基轉移酶A。

結論:表現型O患者中表達的A抗原是由一種功能和免疫反應蛋白(類似於外顯子6和7中的A轉移酶)在320位缺失的等位基因O衍生而來的。盡管其生物學功能在癌症的生物發生中尚不清楚，但A抗原在腫瘤細胞表麵的表達可使其成為臨床有用的腫瘤預後生物標誌物。

關鍵字

ABH抗原;乳腺癌;不兼容的抗原;非deletional O;320年菲律賓人質

簡介

ABH抗原的合成需要表達由ABH編碼的轉移酶土著居民的基因[1,2]。該基因位於人類9號染色體的遠端長臂上。它由7個外顯子組成，編碼354個氨基酸的糖基轉移酶。A、B和O型及其亞型源於基因內的基因變異，基因變異會影響酶的表達或活性，從而導致紅細胞(rbc)表麵可檢測到的血型抗原的質量和/或數量的變化[3-6]。

據報道，基因修飾在來自上皮細胞的幾種癌症中很常見[7,8]。乳腺癌經常引發發生在膜糖綴合物中的糖基化狀態的變化，如BRCA1、BRCA2和Thomsen-Friedenreich唾液酸- lewis抗原，這些都與癌症的發展有關。在糖綴合物中，組織血型ABH抗原也被認為與各種癌症有關[9-12]。

一些研究表明，當惡性過程發生時，正常表達ABH抗原的細胞可能部分失去ABH的表達。A和B抗原的表達已被確定為一個有利的預後因素，因為它們的減少或完全缺失與預後不良[13]相關。新創在一些實體腫瘤中也觀察到與胚胎期相同的ABH抗原表達，包括結直腸癌[6,14-16]。有些紅細胞O型患者的惡性細胞[17]中可能表達不相容的A抗原。

對不相容A抗原的合成機製的研究很少。克勞森和他的同事們認為點突變可能發生在O等位基因，恢複閱讀框，導致a樣轉移酶的產生[18,19]。

然而，問題是，一個特定的突變如何可能是不同個體中不同類型癌症的共同特征。也有人提出了其他的假設，比如在密碼子中使用第二個起始密碼子O等位基因，這可能導致產生一個部分的n截斷酶活性蛋白或一個偽基因的激活。此外，會發生選擇性剪接並移除攜帶c.261G缺失的外顯子6，從而產生一個缺少135個堿基對的轉錄本和一個缺少33個氨基酸的截斷蛋白[20]。

隨著的發現O無共同缺失的等位基因(O03)，頻率為7.3 ~ 8%，假設該等位基因有助於不相容a抗原的表達。

我們篩選了7例在免疫組化檢測的腫瘤中表達A血型抗原的RBC O型乳腺癌患者，以探討A不相容表達的機製。

材料和方法

道德的聲明

該研究是根據《赫爾辛基宣言》進行的，由拉巴特大學理學院拉巴特生物醫學研究倫理委員會(CERBR)評估和批準。

組織樣本

選取7例乳腺癌RBC表型O患者，經免疫組化證實腫瘤中有不相容的A抗原表達。樣本，即患者配對的正常(N)/腫瘤(T)組織，來自Ibn Rochd大學醫院(摩洛哥卡薩布蘭卡)病理科的乳腺腫瘤切除術或乳腺切除術。所有樣本均固定在福爾馬林中，石蠟包埋，包含腫瘤和鄰近正常乳腺組織的代表性部分，均分別表達A和H抗原。

從福爾馬林固定和石蠟包埋的組織中提取DNA

對於每個樣本，腫瘤和鄰近的非癌組織被圈起來，用手術刀刮掉，然後放入用二甲苯和無水乙醇脫蠟的微管中。

根據製造商提供的“組織”協議中推薦的，使用手動QIAamp DNA FFPE組織MinElute®試劑盒(Qiagen)從固定乳腺組織中提取基因組DNA。提取的DNA用60 μL TE Buffer洗脫，-20°C保存後使用。

土著居民的熒光雙級SSP-PCR基因分型

核苷酸位置c.261(PCR 1)和c.703(PCR 2)的土著居民的采用熒光雙序列特異性引物(ASP)- PCR(表1)對基因進行分析。PCR反應的最終反應體積為1X HotStarTaq PCR Master Mix (Qiagen) 10µL，每個引物0.4µM，通用U-FAM引物0.5µM(表1)，純化基因組DNA 2µL。

聚合酶鏈反應	Theoric大小(pb)	等位基因 特異性	引物
			序列(5 '→3 ')
1	243	一個或B	ABO_261G_F一個	GTTTCTTCAGCCAAAGGTCTGACACCCCGGAAGGATGTCCTCGTGGTGA
	222	O	ABO_261X_F一個	GTTTCTTGTGGAAGGATGTCCTCGTGGTAC
	-	-	ABO_261C_RuFb	GTCGTAGTCGACGACCGTTAAATGTCCACAGTCACTCGCCACT
2	153	B	ABO_703A_F一個	GTTTCTTGTGGAGATCCTGACTCCGCTCCTCGGCACCCTGCACCACA
	133	一個或O	ABO_703G_F一個	GTTTCTTGTTCGGCACCCTGCACCCGG
	-	-	ABO_703X_RuFb	GTCGTAGTCGACGACCGTTAGAAATCGCCCTCGTCCTTGG
-	-	-	U-FAM	6-FAM-GTCGTAGTCGACGACCGTTA

表格1：熒光雙工PCR-SSP引物
^一個帶有基因分型序列GTTTCTT的特異前向引物(下劃線)。
^b常見的反引物包含單序列GTCGTAGTCGACGACCGTTA(下劃線)。

PCR擴增產物(0.5µL)與GeneScan™500 ROX™(Applied Biosystems)混合在去離子化甲酰胺Hi-Di™(Applied Biosystems)中。產品在95°C變性5分鍾，然後放置在冰上5分鍾。然後在3130xl遺傳分析儀(Applied Biosystems)中進行毛細管電泳分離單鏈DNA片段，並使用GeneMapper®軟件分析所得電泳結果。最後通過PCR 1和PCR 2擴增結果進行基因型鑒定。

土著居民的測序

外顯子6和7土著居民的用從正常細胞和腫瘤細胞中提取的基因組DNA對基因進行了測序

我們得到的最小覆蓋深度為9X，這為分析snp提供了足夠的深度。深度毯子>5X顯著。將獲得的序列與參考基因組進行比對，並使用NCBI數據庫和ensemble bl進行分析，以確認新突變對蛋白質的影響。如果發現的突變已經被描述，我們會在數據庫中查找。我們還對每種突變的文獻進行了研究。

在這裏，我們隻報道正常和腫瘤DNA之間不同的突變。基於pcr的Sanger測序證實了突變。

結果

土著居民的熒光雙級SSP-PCR基因分型

7例中4/7例為基因型O/O在正常和腫瘤dna中，3/7的基因分型O/O在正常DNA中一個/O(表2)。

樣品標識	組織	組織表型(包含IHC)	基因型一個	核苷酸職位b
				c.261	c.320	c.740
1 2 3 4	正常的	H	O / O	G / delG	A /菲律賓人質	A / G
	腫瘤	一個	O / O	G / delG	A /菲律賓人質	A / G
5、6、7	正常的	H	O / O	G / delG	A /菲律賓人質	A / G
	腫瘤	一個	一個/ O	G / delG	一個/一個	一個/一個

表格2：7例不相容A抗原表達O型患者正常和腫瘤組織的基因型-表型分析。
^一個基因型測定采用熒光雙相SSP-PCR。
^b通過測序確定核苷酸的位置。
變化有下劃線,德爾:刪除。

土著居民的外顯子測序和SNP篩選

土著居民的對腫瘤中表達不兼容A抗原的7名患者的基因測序顯示，存在兩種新的不同突變，據我們所知，這兩種突變在數據庫和文獻中都沒有報道過。第一個突變是外顯子6的單堿基缺失，即c.320delA，這可能導致缺乏催化活性位點的非功能性產物的產生(p.Glu107GlyfsX12)。

第二個突變是第7外顯子的單堿基取代，即c.740A>G，它被認為是用甘氨酸殘基(p.Glu247Gly)取代穀氨酸殘基。

這兩個SNPs在7例患者(即1/N至7/N病例)的正常DNA中均存在，在4/7例患者(即1/T至4/T病例)的腫瘤DNA中均存在。相反，在3/7的患者(即5/T到7/T的病例)中，320位的核苷酸A沒有被刪除，腫瘤DNA中沒有c.740A>G突變(表3)。

此外，所有患者的DNA中均存在等位基因O, 261delG的共同缺失。

情況下數量	土著居民的基因型	c.320delA	c.740A > G
1 / N	O / O	+	+
1 / T	O / O	+	+
2 / N	O / O	+	+
2 / T	O / O	+	+
3 / N	O / O	+	+
3 / T	O / O	+	+
4 / N	O / O	+	+
4 / T	O / O	+	+
5 / N	O / O	+	+
5 / T	A / O	-	-
6 / N	O / O	+	+
6 / T	A / O	-	-
7 / N	O / O	+	+
7 / T	A / O	-	-

表格3：外顯子6和7在7名患者中發生突變。
+:存在突變;
-:無突變。

討論

不相容的A抗原隻存在於腫瘤中，而相鄰的正常乳腺組織沒有標記抗A抗原，也沒有顯示出酶活性，證實了不相容抗原的表達是一種與癌症有關的現象，而不是與個體有關[21-24]。

4/7例正常組和腫瘤組O/O基因分型，3/7例正常組O/O基因分型和腫瘤組A/O基因分型。這一結果與David L的研究結果不一致，David L的研究表明，所有表達A抗原的病例均為基因型O/O，共有缺失261delG[25]。

為了研究導致A抗原表達的可能突變，並回答支持A抗原來自非缺失O等位基因的假設，我們對ABO基因最後兩個外顯子6和7進行了測序。對7例患者的正常DNA和腫瘤DNA的測序顯示，第6外顯子第320 (c.320 delA)和第740 (C.740 A>G)位置存在公社缺失261delG和兩個新的突變。

我們的結果表明，正常DNA基因型的O/O在261,320和740是雜合的。一個等位基因在261處缺失，另一個在320處缺失。由320缺失引起的停止密碼子將產生一個截斷的蛋白質，不能產生糖基轉移酶活性a或B，因此正常組織隻表達O抗原。然而，在表達A抗原的腫瘤組織中，腫瘤DNA在261雜合，缺失320被刪除，導致的停止密碼子不再存在，閱讀框不改變，合成了糖基轉移酶A(圖1)。

圖1:電泳圖顯示1例正常DNA基因型O/O(上)和腫瘤DNA基因型A/O(下)(請注明樣本ID)。

相比之下，4/7基因型O/O患者的腫瘤DNA有相同的c.320 delA和c.740缺失腫瘤組織表達相應的不相容A抗原。通過分析H抗原在正常組織和腫瘤組織中的表達，我們觀察到1例(1/4)患者腫瘤組織中保留了H抗原的表達，且H抗原表達強烈，80%的細胞表達H抗原，40%的細胞表達不相容的A抗原。在這種情況下，測序結果可能取決於樣本組織中DNA的比例或數量。其餘患者(3/4)腫瘤組織無H抗原表達。另一種分子機製可能是不相容A抗原的原因。

另一方麵，Maaf-Hosseini等人[26]指出，非缺失O等位基因有規律地出現，雖然不常見，但在血清學和基因分型中存在嚴重的錯誤解釋風險。該團隊還研究了一例A型低凝集和基因型A1/O1的獻血者。一個缺少c.261delG常見突變的O等位基因，呈現322C>T突變，在107氨基酸之後立即產生一個停止密碼子，已被基因分型為A1等位基因。這種等位基因被認為完全不能產生不活躍的酶，但事實並非如此。事實上，停止密碼子的存在並不一定意味著酶是不活躍的(圖2)。

圖2:O等位基因和a樣等位基因突變的示意圖模型。

人們提出了兩種假設。可能有另一個獨立的基因能夠啟動生物合成轉移酶作為基因轉換。此外，重組事件可能發生在骨髓內或骨髓外的體細胞克隆中，並導致同一人體內的雙群體[24,27]。

除此之外，我們沒有觀察到表達a樣抗原的病例與其他病例在臨床和病理特征上有顯著差異。作者認為不相容的A抗原表達可能是由於對非自身血型抗原[28]的抗體自然發生而導致的癌細胞排斥。

典型的例子是一個小p血型的胃癌患者，其腫瘤組織表達不相容的p抗原。Levine認為，患者完全康複是因為不兼容的輸血P刺激了抗P、P2和pK的合成，因此患者對不兼容的P抗原[29]產生了免疫反應。

也有報道稱，O型血的婦女所生的O型血的孩子比O型血的婦女所生的不相容的a型血[30]的孩子患大腸癌的幾率要高。O型個體中腺癌患者的低發病率提供了不相容抗原A表達作為對癌細胞免疫監測觸發器的重要性的證據。

我們的研究結果表明了同樣的假設，因為抗原A在所有病例的細胞質中都存在。人們認識到，在癌症中誘導免疫反應的大多數腫瘤抗原是內源性合成的胞漿蛋白，並在胞漿中以與1類主要組織相容性複合體相關的小肽降解[31,32]。

結論

我們的結果允許得出這樣的結論:在表型O患者中表達的不相容A抗原在42.86%的病例中來自於一個等位基因O的320位缺失，其功能和免疫反應蛋白類似於外顯子6和7中的A轉移酶。盡管A抗原在癌症生物發生中的生物學功能尚不清楚，但腫瘤細胞表麵A抗原的表達可使其成為臨床有用的腫瘤預後生物標誌物。如果表達A抗原的腫瘤被識別並被免疫係統抑製，那麼它將成為免疫治療的一個有趣的潛在靶點。

的利益衝突

作者聲明沒有利益衝突。

作者的貢獻

所有作者都已閱讀並認可最終版本的手稿。

確認

我們非常感謝Pr S. ZAMIATI為我們提供了進入病理科的便利。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Zouine S, Bakhchan A, Zaid N, Zaid Y, Kojok K, et al.(2016)乳腺癌中不缺失的O參與了不相容的A表達。中華血液疾病雜誌2(1):doi http://dx.doi。org/10.16966/2471 - 5026.113

版權:©2016 Zouine S，等。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年11月02

接受日期:2016年11月14日

發表日期:2016年11月18日