摘要

破骨細胞及其活性是骨形成的關鍵調節因子。然而，研究破骨細胞是困難的。初級破骨細胞培養很難維持和分離。此外，被分離的細胞數量和它們的特性取決於起源和分化協議。這些協議通常在不同的實驗室中開發，並且存在多個協議。目前缺乏研究破骨細胞的細胞係和對破骨細胞分化和培養的徹底研究。RAW264.7細胞係是研究破骨細胞分化及其信號通路最常用的細胞係。RAW264.7細胞不是同種細胞係。它們通常不會分化成破骨細胞但也會分化成其他多核細胞包括巨噬細胞多核細胞。培養RAW264.7細胞的一個挑戰是培養條件。 Different conditions can affect survival, proliferation, and differentiation of RAW264.7 cells. Currently published protocols of culturing RAW264.7 cells often assume multinucleated cells that have three or more nuclei with distinguished osteoclast characteristics (such as TRAP+) as osteoclasts. However, osteoclasts and macrophage polykaryons are almost indistinguishable under a light microscope (TRAP+ with three or more nuclei). The goal of this paper is to examine the effect of culture conditions on the osteoclastogenesis ability of RAW264.7 cells. The focus will be on establishing the crucial parameters for culture density, time of stimulation, RANKL, and L-Gln concentrations. Although we are unable to establish the condition that offers a homogenous population of osteoclasts; nevertheless, we are able to identify the optimal conditions at which osteoclasts are found to be more than macrophage polykaryons. Finally, this article also demonstrates that osteoclasts and macrophage polykaryons can be distinguished by immunofluorescence staining for cathepsin K.

關鍵字

RAW264.7;Osteoclastogenesis;破骨細胞文化協議;巨噬細胞多核體

縮寫

M-CSF:巨噬細胞集落刺激因子;RANKL:核因子κ b配體受體激活劑TRAP:抗酒石酸酸性磷酸酶;均數的標準誤差。

簡介

破骨細胞是多核細胞，對骨吸收和調節骨重塑至關重要。破骨細胞的失調會引起骨質疏鬆症等骨病。破骨細胞可通過分離原代骨髓單核細胞或使用巨噬細胞係獲得。在這兩種情況下，細胞都需要通過M-CSF和RANKL分化為成熟的破骨細胞[1-4]。原代細胞的缺點包括難以獲得真正同質的群體，敏感性和需要額外的營養。小鼠巨噬細胞係RAW264.7最早建立於近40年前[5,6]。從此成為研究單核細胞分化的重要細胞係。近年來，由於該細胞係在RANKL[7]反應中表達RANK和向破骨細胞分化，成為研究破骨細胞分化和活性的有價值的工具。與BMMs不同，RAW264.7可以單獨分泌M-CSF，因此與M-CSF共培養是不必要的。

然而，RAW264.7也不是一個同質細胞係。眾所周知，不同的實驗室有不同的群體，或多或少能夠成為多核細胞。最近的報告表明，培養這些細胞的條件是極其重要的。例如，研究表明細胞密度影響RAW264.7細胞係[9]的刺激。此外，使用這些細胞係的結果也有矛盾的報道[10,11]。在此之前，已有多個已發表的RAW264.7細胞係培養方案[8,12,13]。雖然這些方案提供了從RAW264.7細胞中培養破骨細胞的成功方法，但它們沒有表達在人群中有多核細胞(如巨噬細胞)與破骨細胞混合的問題。已有研究表明，多核異體巨細胞也表達酒石酸抵抗酸性磷酸酶(TRAP)[14]，因此經典的TRAP染色無法區分巨噬細胞多核體和破骨細胞。此外，在這些方案中，L-Gln對破骨細胞培養的重要性沒有得到足夠的重視。Indo等人[15]的一項研究證實了L-Gln對小鼠BMMs破骨細胞分化的重要性。 Nevertheless, byproducts of L-Gln breakdown could be potentially harmful to cells [16].

本文的目的是研究不同培養條件對RAW264.7細胞破骨細胞生成能力的影響。重點是建立培養密度、刺激時間、RANKL和L-Gln濃度。雖然我們無法建立破骨細胞同質種群的條件;然而，我們能夠確定破骨細胞多於巨噬細胞多核體的最佳條件。最後，本文還將證明破骨細胞和巨噬細胞多核體可以通過免疫熒光進行區分。

材料和方法

試劑

胎牛血清(Gemini Bio-Product, Cat#100-106, Lot#A39E00F)。杜爾貝科對Eagle培養基的改性(DMEM加4.5 g/L葡萄糖，不含碳酸氫鈉、L-穀氨酰胺和丙酮酸鈉;康寧,貓# 90 - 013 pb, # 90013165)。穀酰胺(L-Gln;Gemini生物產品，貓#400-106，批次#F11P00F)。青黴素/鏈黴素(Gemini生物產品，貓#400-106，批次#F24P00G)。丙酮酸鈉(康寧，Cat#25-000Cl, Lot#34815011)。中國生物股份有限公司，編號11682- HNCH-100)。ELF97堿性磷酸酶底物(Life Technologies, Cat#E6588, Lot#1704566)。Cathepsin K (Santa Cruz，貓#6506,Lot#J613)。 Alexa fluor 568 (Invitrogen, Cat#A11057, Lot#622091). Acid phosphatase, leukocyte (TRAP) kit (Sigma-Aldrich 387-1KT).

L-Gln濃度

RAW264.7細胞以0.45 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²在6孔板的DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖和1.8 g/L碳酸氫鈉)。2小時後，在含有0、0.5、1、2、4、6mM L-Gln的DMEM培養基中用RANKL 10ng/ml刺激小鼠。試驗期為5 d。第3天用新鮮L-Gln和RANKL更換培養基。進行了三個獨立的試驗。

RANKL濃度

RAW264.7細胞以0.45 × 10的劑量接種⁴/厘米²在6孔板的DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，2mM L- gln)。2小時後，在DMEM培養基中以RANKL 10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml或200ng/ml刺激或不刺激5天。第3天用新鮮RANKL更換培養基。進行了三個獨立的試驗。

細胞密度

RAW264.7細胞按不同密度接種0.225 × 10⁴細胞/厘米²， 0.45 × 10⁴細胞/厘米²， 0.9 × 10⁴細胞/厘米²， 1.8 × 10⁴細胞/厘米²， 3.6 × 10⁴細胞/厘米²或7.2 × 10⁴細胞/厘米²在DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen / Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，2mM L- gln) 6孔板中培養。在用RANKL 10ng/ml刺激前，讓細胞附著並生長2小時、1天、2天或3天。試驗期為5 d。另一組培養皿按上述方法進行播種，但未進行RANKL處理作為對照。第3天用新鮮RANKL更換培養基。進行了三個獨立的試驗。

陷阱染色

去除培養基，用PBS衝洗細胞三次。室溫下用4%多聚甲醛固定15分鍾，搖三次，洗5分鍾。然後，根據製造商協議，在37°C避光條件下，對它們進行抗酒石酸酸性磷酸酶(Sigma-Aldrich)染色90分鍾。細胞核用吉爾號蘇木精反染2-3分鍾。用20X物鏡觀察陽性TRAP細胞。圖像由ImageJ處理。每一張圖片的顏色平衡、亮度和對比度設置都是相同的。傳統上，破骨細胞如果有三個或更多的細胞核就被識別出來。

ELF97磷酸酶底物

RAW264.7細胞以0.9 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²在封麵上鍍在30毫米的盤子。待細胞附著2小時後，用RANKL 10ng/ml刺激5天。另一組蓋套被設置，但沒有被RANKL刺激作為對照。第3天更換培養基。

5天後，去除培養基，用PBS衝洗細胞三次。室溫下用4%多聚甲醛固定15分鍾，用PBS衝洗5分鍾，同時搖晃三次。然後，在室溫避光條件下，在ELF97溶液(110mM醋酸鹽緩衝液，pH5.2, 1.1 mM亞硝酸鈉，7.4mM酒石酸鹽，200 μ M ELF97磷酸酶底物)中孵育1 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min或60 min。用氣卷安裝介質將封麵安裝在載玻片上。采用100倍物鏡熒光顯微鏡觀察。

免疫熒光

RAW264.7細胞以0.9 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²在封麵上鍍在30毫米的盤子。細胞貼壁2小時後，用RANKL 10 ng/ml刺激或不刺激5天。第3天更換培養基。

5天後，去除培養基，用PBS衝洗細胞三次。然後將覆蓋層在-20°C的冰冷甲醇中浸泡10分鍾，然後在-20°C的冰冷丙酮中浸泡1分鍾，使其固定並滲透。用3%的牛血清白蛋白在室溫下阻斷非特異性結合1小時。用1°抗體(山羊多克隆Cathepsin K(1:50稀釋1%PBS)在室溫下孵育1小時(二級對照用3% BSA取而代之)，然後用2°抗體(Alexa 568驢抗山羊(1:50稀釋1%PBS)在光照下孵育1小時。用去離子水1:10000稀釋Hoechst染色，避光1分鍾。用Airvol安裝介質將蓋玻片安裝在載玻片上，用100倍物鏡在熒光顯微鏡下觀察。

統計數據

結果采用單因素方差分析，並采用Chauvenet準則剔除輪廓。

結果

在RANKL缺失的情況下，RAW264.7細胞形成trap陽性多核

為了檢測在RANKL缺失的情況下RAW264.7細胞是否為TRAP陽性，我們對RAW264.7細胞進行了5天的培養。可以看到，細胞分化為巨噬細胞和巨噬細胞多核細胞，如[17,18]所述，TRAP染色均為陽性，多核細胞有三個或更多核。相比之下，我們用10ng/ml RANKL刺激細胞，觀察到trap陽性多核細胞的數量增加(圖1)。

圖1:RAW264.7細胞在RANKL缺失的情況下形成多核細胞。細胞按1.8 × 10的密度培養⁴細胞/厘米²外加或不外加RANKL 10ng/ml刺激。多核破骨細胞被定義為有三個或更多核。

10ng/ml RANKL能促進RAW264.7細胞的破骨細胞生成，但高濃度RANKL不能進一步促進破骨細胞的生成

為了確定RAW264.7細胞向破骨細胞分化的最佳RANKL濃度，繪製了RANKL濃度曲線(圖2a)。RAW264.7細胞在0.45 × 10的DMEM培養基中培養⁴細胞/厘米²(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，2mM L- gln)，不刺激或以10ng/ml, 25ng/ ml, 50ng/ml, 100ng/ml, 200ng/ml RANKL刺激5天。媒體交換在第3天與新的RANKL添加。第5天對多核細胞進行TRAP染色。每口井都拍攝了圖像。每張圖像中計數trap陽性多核細胞。數據歸一化為非rankl刺激控製。數據以平均值±SEM表示。實驗采用三次重複。對照刺激中trap陽性的出現表明在RAW264.7細胞係的正常破骨細胞培養係統中形成了多核細胞(圖2b)。結果表明，10ng/ml RANKL能顯著促進RAW264.7細胞總多核細胞的形成。 However, RANKL didn’t enhance the total number any further at concentrations above 10ng/ml.

圖2:RANKL濃度對RAW264.7細胞破骨細胞發生的影響。RAW264.7細胞在0.45 × 10的DMEM培養基中培養⁴細胞/厘米²無刺激或以10ng/ ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml RANKL刺激5天。多核細胞進行TRAP染色。多核破骨細胞定義為具有3個或3個以上核。a)在一定濃度下RANKL介導的多核細胞形成的代表性圖像。b) TRAP陽性多核細胞數量定量分析。單因素方差分析差異有統計學意義(P<0.05)。

L-Gln在1-2mM範圍內增強RAW264.7細胞的多核細胞分化，高濃度時抑製多核細胞分化

L-Gln對細胞生長和增殖很重要。然而，L-Gln的副產物氨/銨離子是潛在的有害的，對生長和增殖有負麵影響。因此，我們確定了培養體係的最佳L- gln濃度，並對各種L- gln濃度進行了測試(圖3)。RAW264.7細胞在DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，0mM, 0.5mM, 1mM, 2mM, 4mM或6mM L- gln)中添加RANKL 10ng/ml, 0.45 × 10培養5天⁴細胞/厘米²．在第3天交換了新媒體，添加了新的RANKL。第5天對多核細胞進行TRAP染色。每口井都拍攝了圖像。每張圖像中計數trap陽性多核細胞。數據歸一化為0mM L-Gln對照。數據以平均值±SEM表示。實驗采用三次重複。單因素方差分析差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明，L-Gln能顯著促進RAW264.7細胞在1-2mM處的多核細胞分化。 However, as concentration increased to 4mM the differentiation was inhibited. At 6mM there was no statistical difference between 1-2mM or control, however, it showed a decreasing trend. Noteworthy, even though there was no statistical significance between 4mM and 6mM L-Gln, however, there was an upward trend from 4mM to 6mM. Thus, it could be speculated that higher concentration of L-Gln could increase osteoclast differentiation again and even exceed the effect of 1mM or 2mM L-Gln. Future investigation should be carried out to further determine the effect of higher concentration of L-Gln on osteoclast differentiation of RAW264.7 cells.

圖3:L-Gln濃度對RAW264.7細胞破骨細胞發生的影響。RAW264.7細胞在含RANKL 10ng/ml的DMEM培養基中以0.45 × 10的速率培養5天⁴細胞/厘米²．細胞進行TRAP染色。

RAW264.7細胞的破骨細胞分化依賴於種子密度

接下來，我們評估了種子密度對破骨細胞分化的影響。種子密度是細胞分化的主要參數[19]。例如，在1000-2000個細胞/cm2中，細胞密度增強了分化，但在4000-8000個細胞/cm2時下降。為了評估種子密度對大量破骨細胞和多核細胞的影響，RAW264.7細胞在不同密度下被播種(圖4a和4b)。RAW264.7細胞以0.225 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²， 0.45 × 10⁴細胞/厘米²， 0.9 × 10⁴細胞/厘米²， 1.8 × 10⁴細胞/厘米²， 3.6 × 10⁴細胞/厘米²或7.2 × 10⁴細胞/厘米²在DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，2mM L- gln)中培養。2小時後無刺激或用RANKL 10ng/ml刺激5天。第3天交換培養基，加入新的RANKL，對多核細胞進行TRAP染色。每口井都拍攝了圖像。每張圖像中計數trap陽性多核細胞(圖4c)。將數個RANKL刺激的多核細胞除以數個相同密度的DMEM對照的多核細胞，計算折疊變化(圖4d)。用折疊變化來估計在不同播種密度下破骨細胞的生成量。數據以均值+/-SEM表示。實驗采用三次重複。單因素方差分析差異有統計學意義(P<0.05)。 Multinucleated cell formation increased as seeding density increased (Figure 4c) in both nonstimulated and stimulated RANKL 10ng/ml. In addition, it showed that seeding density of 1.8 × 10⁴在多核細胞中產生更多的破骨細胞(圖4d)。

圖4:種子密度對RAW264.7細胞破骨細胞分化的影響。RAW264.7細胞以0.225 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²， 0.45 × 10⁴細胞/厘米²， 0.9 × 10⁴細胞/厘米²， 1.8 × 10⁴細胞/厘米²， 3.6 × 10⁴細胞/厘米²或7.2 × 10⁴細胞/厘米²並在DMEM培養基中培養。2小時後，給予無刺激或RANKL 10ng/ml刺激5天。多核細胞進行TRAP染色。破骨細胞被定義為有三個或更多核。a)非rankl不同播種密度下多核細胞形成的代表性圖像。b) RANKL中不同播種密度下多核細胞形成的代表性圖像c) TRAP陽性的多核細胞數量。d) TRAP染色的多核細胞在RANKL刺激和DMEM對照間的倍性變化。RANKL刺激組的多核細胞數除以相同密度DMEM對照組的多核細胞數。

刺激起始時間延遲24小時可增強RAW264.7細胞的破骨細胞分化

不同的研究小組通常使用不同的RAW264.7培養協議。每一種通常表示不同的刺激開始時間。例如，一組傾向於電鍍後立即開始刺激，而另一組則傾向於孵育一晚後再進行刺激[11,12]。為了確定RAW264.7細胞的破骨細胞形成是否依賴於刺激開始時間，我們分別在2小時、1天、2天、3天後對RAW264.7細胞進行RANKL刺激(圖5)⁴細胞/厘米²， 0.9 × 10⁴細胞/厘米²，或1.8 × 10⁴細胞/厘米²在DMEM培養基(10%FBS v/v, 1% pen /Strep v/v, 1%丙酮酸鈉v/v, 4.5 g/L葡萄糖，1.8 g/L碳酸氫鈉，2mM L- gln)中培養。分別堅持2小時、1天、2天、3天，然後用RANKL 10ng/ ml或DMEM刺激5天。刺激3天後，更換培養基，用新的RANKL刺激細胞。第5天細胞固定染色。每口井都拍攝了圖像。每張圖像中計數trap陽性多核細胞。通過從RANKL刺激到相應的DMEM對照的多核細胞總數的分離，估計破骨細胞的數量。數據以平均值±SEM表示。結果表明，播種1 d後的細胞刺激在3種測試密度下的破骨細胞數量均高於2小時後的對照組。密度1.8 × 10⁴細胞/厘米²0.9 × 10⁴細胞/厘米²在2天和3天的刺激下，分別與1天的刺激有相似的增加。

圖5:刺激時間對RAW264.7細胞破骨細胞分化的影響。RAW264.7細胞以0.45 × 10的劑量接種⁴細胞/厘米²， 0.9 × 10⁴細胞/厘米²，或1.8 × 10⁴細胞/厘米²並在DMEM培養基中培養。分別堅持2小時、1天、2天、3天，然後用RANKL 10ng/ml或DMEM刺激5天。多核細胞進行TRAP染色。破骨細胞被定義為有三個或更多核。

ELF97堿性磷酸酶底物不能區分多核細胞和破骨細胞

ELF97磷酸酶底物是酶標記的熒光底物。它被用來檢測破骨細胞[20]，並被證明是特異性的。因此，為了區分多核細胞和破骨細胞，采用ELF97磷酸酶底物熒光基TRAP(圖6)。細胞以0.9 × 10的劑量接種⁴cell /厘米²生長在封麵上。RANKL 10ng/ml或DMEM刺激5天。用4%多聚甲醛固定，在ELF97溶液(110mM醋酸鹽緩衝液，pH5.2, 1.1 mM亞硝酸鈉，7.4mM酒石酸鹽，200 μ M ELF97磷酸酶底物)中孵育1min, 5min, 10min, 15min, 30min，或60min。在熒光顯微鏡下用油100倍物鏡觀察細胞。然而，在對照組DMEM刺激中也檢測到熒光。這並不奇怪，因為有報道稱多核細胞也表達抗酒石酸酸性磷酸酶。

圖6:堿性磷酸酶底物ELF97熒光TRAP染色。細胞以0.9 × 10的倍率播種⁴cell /厘米²生長在封麵上。RANKL 10ng/ml或DMEM刺激5天。用4%多聚甲醛固定，在ELF97溶液中孵育1min, 5min, 10min, 15min, 30min, 60min。

組織蛋白酶K免疫熒光染色可區分多核細胞和破骨細胞。

由於ELF97磷酸酶不能區分多核細胞和破骨細胞，我們轉向使用抗破骨細胞標記物Cathepsin K抗體的免疫熒光。細胞以0.9 × 10的倍率播種⁴細胞/厘米²生長在封麵上。RANKL 10ng/ml或DMEM刺激5天。在-20°C甲醇中固定和滲透，然後在-20°C丙酮中。阻止了bsa為3%。用山羊多克隆組織蛋白酶K孵育，然後用Alexa 568驢抗山羊。核用Hoechst染色。在熒光顯微鏡下用油100倍物鏡觀察細胞。結果顯示，隻有受RANKL刺激的多核細胞才會分泌Cathepsin K(圖7a)。定量分析顯示，rankl刺激組組織蛋白酶K的表達高於對照組(圖7b)。因此，這證明了免疫熒光可以用來區分多核細胞和破骨細胞。

圖7:多核細胞和破骨細胞的免疫熒光。細胞以0.9 × 10的倍率播種⁴細胞/厘米²生長在封麵上。RANKL 10ng/ml或DMEM刺激5天。在-20°C甲醇中固定和滲透，然後在-20°C丙酮中。阻止了bsa為3%。用山羊多克隆組織蛋白酶K孵育，然後用Alexa 568驢抗山羊。細胞核用Hoechst染色。一)代表性的圖片b)組織蛋白酶K表達的定量分析。

在既定的培養條件下，BMP2增強了RAW264.7的破骨細胞發生

為了證實和驗證新建立的培養條件，用BMP2刺激細胞。據報道，BMP2在促進小鼠破骨細胞前體的破骨發生中發揮積極作用，通過BMPRII敲除抑製BMP2信號通路抑製RAW264.7細胞[21]的破骨發生。然而，BMPRII配體包括BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP10-14[22]。Zheng等[23]報道BMP2同型二聚體增加了RAW264.7細胞的破骨細胞發生。結果表明，在RANKL+培養基中加入40nM BMP2增強了破骨細胞的分化(圖8)，驗證了建立的培養條件。

圖8:BMP2增強了RAW264.7細胞的破骨細胞發生。細胞以0.45 × 10的倍率播種⁴細胞/厘米²6-well-plate。用RANKL 10ng/ml、RANKL+BMP2 40nM或DMEM刺激5天。固定細胞並進行TRAP染色。破骨細胞被定義為有三個或更多核。

討論

RAW264.7細胞的培養已被用於破骨細胞和骨礦化的研究超過30年。然而，RAW264.7細胞不是同質細胞係。眾所周知，不同的實驗室會有不同的群體，或多或少能夠成為多核細胞。因此，我們直接從美國類型培養中心(ATCC)購買了RAW264.7細胞，而不是從其他實驗室獲得。從ATCC收到的時間開始，經過20次傳代後，一些發表的協議建議使用新細胞[8,12,13]。此外，這些方案為如何將RAW264.7細胞分化為破骨細胞提供了很好的指導。例如，這些協議表明，DMEM在用於RAW264.7培養時，與RANKL共培養也是一種有效的分化培養基。因此，本研究選擇使用DMEM而不是alpha-DMEM。然而，他們還沒有在人群中獲得除破骨細胞以外的多核細胞的問題。在本研究中觀察到，在RAW264.7傳代中形成了比單核細胞更大的細胞(有些細胞有3個以上的細胞核)，然後將其分裂並置於6孔板中進行實驗(數據未顯示)。 The formation of these bigger cells was observed even in passage lower than 20. These multinucleated cells also express TRAP [14]. Here, we showed that in our culture system multinucleated cells were formed in the absence of RANKL and were TRAP-positive (Figure 1). Thus, we were aiming to re-establish osteoclast culture method from RAW264.7 cells to combat this issue.

RANKL是破骨細胞分化的信號因子。然而，研究人員一直在使用不同數量的RANKL用於培養係統，這取決於細胞類型。本研究表明，當濃度為10ng/ml時，RANKL能有效促進總多核細胞的形成。在較高的濃度下，RANKL沒有進一步增加這個總數(圖2b)。說明RAW264.7細胞中破骨細胞和/或其他多核細胞的形成不依賴於RANKL的濃度。

Indo等人證實了L-Gln在破骨細胞培養基中的重要性。在該研究中，L-Gln添加到無L-Gln培養基中增加了BMMs的破骨細胞分化。研究顯示L-Gln使破骨細胞分化從0.5mM增加到1.5mM。但本研究未發現高濃度L-Gln對破骨細胞分化的影響。

幾十年來，L-Gln一直被認為是培養係統中細胞生長和分化的重要因素[24,25]。Indo等人[15]證實了L-Gln在破骨細胞培養基中的重要性。在該研究中，在無L-Gln培養基中補充L-Gln增加了小鼠BMMs的破骨細胞分化。研究顯示L-Gln使破骨細胞分化從0.5mM增加到1.5mM。但本研究未發現高濃度L-Gln對破骨細胞分化的影響。L-Gln分解的副產物包括氨/銨離子對細胞[16]是有毒和有害的。我們發現在L-Gln的1-2mM處多核細胞總數最多，但在L-Gln的4-6mM處多核細胞總數減少(圖3b)。這可能是由於培養係統中L-Gln的分解導致氨/銨離子的積累。不足為奇的是，在0-1mM的L-Gln中，多核細胞的總數最少。

相鄰細胞間通過縫隙連接通訊的接觸抑製抑製細胞增殖。因此，在培養係統中，播種密度影響生長和增殖是不足為奇的。但在這裏，我們發現種子密度也影響破骨細胞和多核細胞的形成。我們觀察到，無論培養基中是否添加RANKL，種子密度對總多核細胞的形成都有積極的影響(圖4c)。我們確定破骨細胞的形成在1.8個細胞/厘米時達到峰值²(圖4 d)。綜上所述，種子密度與多核細胞的形成呈正相關，而破骨細胞的形成則服從正態分布曲線。

接下來，我們想看看延遲刺激是否會影響RAW264.7細胞的破骨細胞分化。令我們驚訝的是，我們發現在播種1天後的刺激下，在所有三種測試密度下，破骨細胞的數量都增加了(圖5)。

接下來，我們想要建立一種方法來區分多核細胞和破骨細胞。為此，我們使用ELF97堿性磷酸酶底物[20]進行熒光TRAP染色。該磷酸酶底物是一種新的TRAP檢測方法，具有較好的分辨率[20]。因此，本研究利用它來區分破骨細胞和巨噬細胞多核體。然而，ELF97可能是其他磷酸酶的底物。為了減少非特異性信號，隻考慮有三個以上核的細胞。然而，結果表明，這種方法並不隻針對破骨細胞(圖6)。我們觀察到，染料會作為所有trap分泌的多核細胞(包括破骨細胞和巨噬細胞多核細胞)的底物。因此，這使我們轉向免疫熒光法。使用抗破骨細胞標記物Cathepsin K的抗體，我們能夠區分多核細胞和破骨細胞(圖7)。對Cathepsin K表達的定量分析顯示，在rankl刺激的細胞中，Cathepsin K表達較高。雖然已知組織蛋白酶K在I型和II型膠原[26]等骨基質蛋白的退變中發揮作用，但它也被證實在破骨細胞的骨吸收中發揮作用[27,28]。在本研究中，沒有進行骨吸收實驗來進一步研究破骨細胞與其他多核細胞的差異。 Nevertheless, the increase in bone resorptive function of osteoclast was suggested via the increase in cathepsin K expression (Figure 7). Another reason was that macrophage polykayons were reported to have bone resorptive ability like osteoclasts [29,30]. Thus, bone resorption assay would be excessive for the purpose of this paper.

結論

建立並優化RAW264.7細胞破骨細胞培養條件。此外，我們沒有發現任何證據表明不同的培養條件會影響破骨細胞的大小(數據未顯示)。用BMP2刺激RAW264.7細胞，確定了最佳培養條件(圖8)，結果顯示BMP2促進RAW264.7細胞向破骨細胞分化，這與Jensen和Zheng Y等[21,23]的報道相似。雖然，在我們的培養係統中，其他多核細胞仍然能夠形成，但是，我們能夠建立一種方法，產生比多核細胞更多的破骨細胞。

確認

本出版物中報道的研究得到了美國國立衛生研究院關節炎、肌肉骨骼和皮膚病研究所的資助，資助編號為4RO1AR06424304。本文內容僅由作者負責，並不代表美國國立衛生研究院的官方觀點

的利益衝突

作者聲明他們沒有利益衝突。

參考文獻

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Nguyen J, Nohe A(2017)影響RAW264.7細胞破骨細胞發生的因素。生物化學分析研究2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.109

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出版的曆史:

收到日期:08年8月2017年

接受日期:2017年8月21日

發表日期:2017年8月28日