肯尼斯·C·帕克gydF4y2Ba1 *gydF4y2Ba傑杜gydF4y2Ba2gydF4y2BaStephen J HattangydF4y2Ba1gydF4y2Ba
1gydF4y2BaVirgin Instruments, 100套房，261雪鬆山街，馬爾伯勒，MA 01752gydF4y2Ba*通訊作者:gydF4y2Ba肯尼斯·C·帕克，維珍儀器公司，100套房，雪鬆山街261號，馬勒堡，郵編01752。電話:508-460-1600轉125。gydF4y2Ba電子郵件:gydF4y2Bakenneth.parker@simultof.comgydF4y2Ba
肽質量指紋(PMF)通常被認為是可行的蛋白質消化後廣泛分離。雞的肌肉包括兩種基本的肌肉類型——通常被稱為黑肉和白肉。使用從均質雞肌肉的胰蛋白酶消化液開始的高分辨率PMF，肌凝蛋白重鏈使用的顯著差異是明顯的。此外，可以檢測到糖酵解酶和其他豐富的肌肉蛋白質的使用發生了較小的折疊變化。LC-MALDI-TOFTOF實驗證實了這些變化背後的多肽。因此，在肌肉製劑中大量蛋白質的使用可以用最少的製備步驟進行區分，這可能有助於對人類肌肉活檢樣本進行分類。gydF4y2Ba
肽質量指紋圖譜，PMF, MALDI，肌肉，肌球蛋白gydF4y2Ba
aa;氨基酸(年代);德勤:二硫蘇糖醇;HCCA: α -氰基羥基肉桂酸;HPLC:高效液相色譜法;MALDI:基質輔助激光解吸電離;MS/MS:串聯質譜;MYH:肌凝蛋白重鏈;M /z:質荷比;主成分分析:主成分分析; PMF: Peptide Mass Fingerprinting; ppm: parts per million; SDS: sodium dodecyl sulfate; TOF: time of flight; 1D: 1-dimensional; 2D: 2-dimensional
當實驗的目標是確定複雜生物樣品中區分不同樣本的蛋白質時，生物化學家通常使用1D SDS凝膠或2D等電聚焦/ SDS凝膠來揭示表達模式的定量變化。最近，質譜技術已經發展到從SDS凝膠可檢測的數十種蛋白質擴展到數千種蛋白質，通常借助添加重原子標記的合成多肽來提高定量[1,2]。然而，這些質譜測量通常需要大量的蛋白質和/或肽分離來進行鑒定[3-8]。這些分離需求會引入可變性，降低吞吐量並增加分析費用。gydF4y2Ba
在另一個極端是沒有分離的質譜，導致光譜的峰值對應於最豐富和最容易檢測的肽段。在蛋白質製劑的胰蛋白酶消化的情況下，大多數MALDI峰對應於含有精氨酸的多肽。根據科學文獻，在複雜的蛋白質混合物上嚐試肽質量指紋(PMF)是不可行的，因為從任何特定的蛋白質中產生的肽太少了。然而，最近MALDI質譜儀的進步使精確的質量測量達到百萬分之幾(ppm)。質量精度的提高顯著降低了肽序列的數量，可以解釋每個峰值，因此增加了PMF[9]的有用性。gydF4y2Ba
這篇稿子的目的是表明用PMF可以正確地識別複雜混合物中的主要蛋白質。利用雞肌肉的胰蛋白酶消化作為模型係統，還可以正確區分密切相關的蛋白質異構體，如肌凝蛋白重鏈，並確定豐富蛋白質的一些定量變化。為此，我們采用了針對MALDI MS數據優化的PMF程序。該程序充分利用了含精氨酸多肽[10]較高的可檢測性，今天的質譜儀可以獲得的高質量精度，以及質量表的峰值強度。複雜混合物的典型質譜在m/z 800到4000之間包含數百個峰，隨後同位素團簇還原為單同位素質量。在第一輪PMF中，最豐富的蛋白質被識別出來，這產生了一組可用於內部校準的質量。在這一階段，應使用有關樣品的生物學信息，以確保選擇適當的蛋白質進行校準。在雞肌肉樣本中，根據生物學原理，最豐富的蛋白質是肌動蛋白。在對肌動蛋白肽進行內部校準後，可以收緊質量公差，從而能夠識別額外的蛋白質。使用這些方法，我們證明了基於兩個多肽識別小蛋白質是可能的，前提是多肽包含精氨酸和胰蛋白酶的預期最終消化產物。gydF4y2Ba
之所以選擇雞肌肉係統，是因為雞肌肉樣本很容易從雜貨店買到。如果PMF在雞肉上成功，那麼它也應該適用於人類肌肉活檢樣本。已經確定的是，肌球蛋白重鏈異構體的模式在肌肉病理中發生改變，通常是由於潛在的肌肉纖維使用[11]的變化。然而，當處理人體組織時，實驗前必須遵循嚴格的臨床指南。在雞肉體係中，眾所周知有兩種肉，白肉和黑肉。特別是白肉(如胸大肌)有更多的快肌纖維，深色肉(如淺內收肌和腓腸肌外側肌)有更多的慢肌纖維[12-15]和更多的肌紅蛋白，這被認為是直接負責肉的顏色[16]。此外，在蛋白質組學分析中，獲取新鮮切除的組織通常被認為是無價的，因為蛋白質分解可能會混淆蛋白質識別過程[17]。如果用PMF進行蛋白質鑒別被證明從雜貨店的雞肉開始是可行的，那麼鑒別過程應該足夠穩健，以便在人類肌肉活檢樣本中發生的任何降解都不會成為異構體鑒別的限製因素。最後，雞的蛋白質組被很好地描述為[18]，這是PMF成功的必要條件。gydF4y2Ba
四份雞大腿深色肉樣本(淺收肌和腓腸肌外側)和三份白肉樣本(胸大肌)來自當地一家超市。gydF4y2Ba
每個樣本都來自肌肉的中間部分，而不是軟骨、肌腱或皮膚附近。樣品(約100 mg)均質於1 mL含1% SDS和10 mM二硫蘇糖醇(DTT)的100 mM Tris pH 8.0中，加熱至90℃幾分鍾，冷卻至室溫，並與25 mM碘乙酰胺烷基化。過量的烷基化劑用100mm巰基乙醇淬滅。然後將大約10%的樣品沉澱在丙酮中，丙酮將大部分鹽、核酸和脂類去除到上清液中。用牛胰蛋白酶(Sigma)以約200:1的底物蛋白:胰蛋白酶在37℃下消化過夜。gydF4y2Ba
隻要大多數底物蛋白質被消化，隻要胰蛋白酶自消化肽在MALDI光譜中保持不可見或幾乎不可見，胰蛋白酶與蛋白質底物的比例就不是關鍵。在這些條件下，含有蛋氨酸的多肽主要以還原蛋氨酸的形式被回收，而酪氨酸之後的裂解所產生的乳糜蛋白酶樣汙染所產生的肌動蛋白多肽是檢測不到的。如果通過適當的消化協議調整達到這兩個目標，則可以簡化光譜解釋。gydF4y2Ba
將消化液稀釋到5 mg/ml α -氰羥基肉桂酸(HCCA)中，溶於含有0.1%三氟乙酸的75%乙腈中，並在MALDI平板上重複標記。對肌動蛋白的主要胰蛋白酶肽進行了內部光譜校準，這是未分離骨骼肌蛋白的任何胰蛋白酶消化中最強的。最高質量的光譜通常是在肽消化液的中間稀釋條件下獲得的，其目標是獲得具有盡可能多的高分辨率同位素簇的光譜。gydF4y2Ba
光譜是在維珍儀器公司生產的定製的MALDI反射器上獲得的，該反射器有一個7.5米的飛行管，並收集了一式兩份。使用2.4激光脈衝電流和1500道爾頓的聚焦質量，在1khz的激光頻率下每1ns收集一次數據;掃描速度為1毫米/秒，質量範圍為10-2200道爾頓(35 -530微秒)。分析區被泵降至2 × 10-8托爾的壓力。5000-6000次激光發射的典型平均光譜如圖1所示。這種平均過程幾乎不需要額外的MS采集時間，但提高了小峰的質量精度和同位素包絡強度。gydF4y2Ba
圖1:gydF4y2Ba白肉與深色肉光譜的比較。上麵兩條軌跡顯示質量在米/z 900和2000之間。在所有光譜中標記了七個顯著的質量:A，肌動蛋白;MYL，肌球蛋白輕鏈;MYH，肌凝蛋白重鏈(大多數異構體共享)。下方的痕跡突出了由於肌凝蛋白重鏈多態性而具有顯著差異的區域。在3gydF4y2Ba理查德·道金斯gydF4y2Ba微量，峰值在1384.74對應一種診斷為白肉的肌凝蛋白重鏈肽。來自深色肉的相應肽出現在1398.76。1391.85和1382.65的峰值對應於烯醇化酶(在白肉中更豐富)和廣泛共享的肌凝蛋白重鏈肽。頂部譜中，1373.69峰主要對應肌凝蛋白重鏈。在深色肉中，熱休克蛋白B1中具有類似質量的峰值(1373.74)更為顯著。gydF4y2Ba
第一階段使用Virgin Instruments的SimulTOF軟件進行所有的PMF實驗。該軟件內置了平均和峰值表去同位素功能。它還有一個基於ChemPlex軟件[19](VChemplex)的內置PMF程序。首先，每個理論肽根據其序列和側殘基分配一個化學分數。含有精氨酸的肽段，沒有缺失的裂解和沒有妥協的側殘基(如酸性殘基)被分配為20分，而不含精氨酸的含賴氨酸肽段的最高分是2分。VChemplex首先篩選含有至少一個含精氨酸的胰蛋白酶肽的蛋白質，沒有遺漏的裂解，映射到100個最強峰中的任何一個的4ppm以內。這種質量精度要求內部校準。當一個蛋白質通過了第一個限製，下一步程序需要至少一個額外的肽匹配到10ppm以內，包含完整峰值列表中的一個漏切。計算得到的蛋白質分數與蛋白質所占的峰值強度百分比成正比，與所映射的預期胰蛋白酶肽的百分比成正比，其中每個肽都有一個基於其序列和側翼殘基的匹配數值分數，並與匹配的強度加權平均ppm成反比[19]。最初的蛋白質和匹配的多肽列表通常包含數千個蛋白質，然後進行過濾，隻包括那些匹配的多肽的總化學分數占蛋白質中所有多肽總化學分數的至少20%的蛋白質。 This drastically reduces the proteins to be considered further. The remaining list of proteins is sorted by decreasing overall score, and the protein list undergoes a process termed iterative subtraction. The score of each protein is recalculated but the masses in the peak list become unavailable for matching by lower ranking proteins, if there is a match to a credible peptide from a higher ranking protein. The iterative subtraction process ensures that when multiple isoforms of a protein (like myosin) are present that share common peptides, there will always be one ‘winning’ isoform. Each peak list, which typically contained about 400 deisotoped peaks, was searched against a combined Swiss-Prot and TrEMBL database containing 15148 protein sequences. This combined database was downloaded from the UniProt web site (http://www.uniprot.org/), and reconfigured into a sqlite3 database for use with VChemplex. The input for VChemplex is the MALDI spectrum displayed to the user (using the SimulTOF viewer), and is dependent on the peak detection settings selected by the user. The deisotoping function within the SimulTOF viewer maps the area of each isotope cluster to the mono isotopic mass in the peak list. Online Resource Table S1 contains a list of all of the settings used here for protein identification.
為了解決假陽性的問題，每個光譜還使用包含人類和斑馬魚序列以及雞(204,304個蛋白質序列)的數據庫進行PMF分析。當搜索這個較大的數據庫時，在1400個查詢(來自14個樣本的100個峰值)中，隻有678個肽被正確分配(參見“相同的MSMS”列)，而在搜索較小的數據庫時，則有776個肽被正確分配。令我們驚訝的是，PMF識別出27個雞肉多肽，這些多肽與MS/MS數據一致，而這些數據在搜索較小的雞肉數據庫時沒有被識別出來(在“SeqLarge”列中以藍色突出顯示)，可能是因為人類或斑馬魚蛋白質“去掉”了一些塊，否則這些塊將被匹配到不正確的雞肉蛋白質。根據這些結果，似乎大部分鑒定都是正確的，MS/MS數據為確定正確的鑒定提供了有用的手段。gydF4y2Ba
在MS/MS鑒定了豐富的雞多肽(見下文)後，對sqlite3蛋白質數據庫中的一些序列進行了修改，以對應眾所周知的化學計量化學修飾。這有利於後續的多肽和蛋白質的PMF鑒定，因為VChemplex程序將得分較高的特定蛋白質亞型，如果預期的修飾存在，如果預期的化學修飾不存在，得分較低。因此，預期的雞肌肉蛋白的n端變化，如成熟蛋白的n端由於乙酰化(肌動蛋白和肌球蛋白)和信號序列的去除而發生的變化，被輸入到蛋白質序列中。根據Swiss-Prot數據庫的注釋和MS/MS鑒定，肌動蛋白和肌凝蛋白重鏈中的一個組氨酸殘基在所有顯著亞型中都類似地轉化為甲基組氨酸。gydF4y2Ba
將消化後的肌肉樣本等分注射到使用150 × 0.3 mm Prot 200 C18 5 μ m柱(the Nest Group, Southboro, MA)的高效液相色譜係統中，並通過梯度洗脫分離。緩衝液A為2%乙腈/ 0.1%TFA，緩衝液B為85%乙腈/ 5%異丙醇/ 10%水/ 0.1%TFA。梯度分為3段，從2-10%緩衝B超過5 min, 10%到45%緩衝B超過60(或130)min, 45% - 100%緩衝B超過10 min，流速為4µl/min。添加基質(4 μ l/min, 5 mg/ml HCCA在75%乙腈/0.1% TFA和10皮摩爾/ μ l合成肽標準)，然後每5秒在384個斑點板上進行斑點檢測。注意，這些分離隻用於支持MS/MS分析。gydF4y2Ba
質譜采集在原型質譜儀上，使用7.5 m飛行管，在1khz下，每ns(~ 35微秒~ ~530微秒)的m/z範圍為10 ~ 2200。2200的m/z上限是必要的，這是由於數字化儀的容量，因為采集是從10 m/z開始的。光譜可以從m/z 500(甚至800)開始獲得，並將導致與PMF匹配的更多峰值。通常，5000個光譜被平均在一起，得到35000的分辨率。光譜在肌動蛋白上進行內部校準。MS/MS譜采集在源電壓為1kv和第二源電壓為2kv的SimulTOF-300上。通常，每個前驅體收集5000 -20,000個樣品，每個點最多收集10個前驅體。gydF4y2Ba
使用內置在SimulTOF軟件中的VChemplex程序進行指紋識別。搜索參數元數據和峰值列表，肽和蛋白質識別下載到SQLite3數據庫。為了加快SQL查詢的速度，首先將理論質量和峰值m/z映射到它們最近的質量庫，通過質量的四舍五入除以1.0005計算。這支持基於整數的首次傳遞對齊。gydF4y2Ba
要進行PCA分析，必須將數據組織成質量特征與樣本的矩陣，並適當歸一化。執行以下步驟來獲得這個矩陣。對於這裏描述的實驗，兩個光譜從七個不同的肌肉消化獲得。在PMF之後，將輸出存入SQLite3數據庫，然後導入Microsoft Access。根據質量缺陷去除符合標準或非多肽的質量塊。然後為每個光譜分配每個峰的強度等級。然後將得到的1400個質量的表(表S2)分組到質量箱中，並確定每個質量箱的標準差。在這個數據集中，由於質量的標準差大於0.025，有7個質量箱被手動分割為兩個質量特征。在這一階段，對組合質量列表進行過濾，以包含在14個樣本中至少遇到3次的質量特征。在這些數據中，產生了157個質量特征，質量範圍在m/z 800到2115之間。 To prepare the mass features for PCA, the 157 peaks and their raw intensities were copied into excel, and then doubly normalized, first by column, and then by row (converting each intensity into a percentage). A comma delimited file consisting of these data was imported into R (see Table S3, columns “Peak” and columns “1a-7b”), and PCA analysis was performed using the prcomp function in the R statistical package (http:// www.r-project.org/). The principal component table from R was then exported back into excel for plotting purposes.
從這些光譜中可以看出，大部分強峰是共有的。插圖顯示了m/z 1362到1410之間的區域。有些波峰在一個光譜中很強，但在另一個光譜中很弱或幾乎不存在;例如，峰值為1384.74(白肉較高)，峰值為1398.76(深色肉較高，白肉較低)。圖1中的插圖所顯示的差異峰值強度並不局限於這個特定的質量區域。為了建立這些模式的可重複性，研究人員在不同的時間從白色和深色肉中提取額外的樣本，這些樣本來自不同的雜貨店。在所有情況下，白肉和黑肉之間的差異都很明顯，這表明在白肉和黑肉之間，某些蛋白質的豐度存在顯著差異。後續的實驗包括三個白肉樣本和四個深色肉樣本，每個樣本都在MALDI板上重複被發現，得到14個光譜，詳細描述如下。gydF4y2Ba
IdgydF4y2Ba一個gydF4y2Ba |
樣本gydF4y2BabgydF4y2Ba |
類別gydF4y2BacgydF4y2Ba |
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平均gydF4y2Ba |
407.6gydF4y2Ba |
59.2gydF4y2Ba |
53.4gydF4y2Ba |
72.8gydF4y2Ba |
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總和gydF4y2Ba |
5707gydF4y2Ba |
829gydF4y2Ba |
748gydF4y2Ba |
1019gydF4y2Ba |
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表1:gydF4y2Ba樣品gydF4y2Ba
樣品gydF4y2Ba一個gydF4y2BaID，樣品的索引號。gydF4y2BabgydF4y2Ba樣本，描述生物文摘的鑰匙。gydF4y2BacgydF4y2Ba類別，由PCA分析得出樣本所屬的類別，如圖2A所示。gydF4y2BadgydF4y2Ba峰值，用於PMF指紋識別的峰值數量。如果每個100 amu增量中有30個峰值，則可以達到420的最大值。gydF4y2BaegydF4y2Ba100強峰:gydF4y2BafgydF4y2BaPMF，即與表S4中所列的前10個蛋白質中的任何一個相匹配的前100個峰的數量，無論是否有MS/MS數據支持。gydF4y2BaggydF4y2Ba正確，這些峰的數量與MS/MS分析一致。gydF4y2BahgydF4y2BaMSMS，即前100個峰的數量，其身份可以從對類似雞肌肉胰蛋白酶消化液進行LC /MALDI分析後進行的MS/MS分析中推斷。用MS/ MS可以識別的多肽比單用PMF可以正確分配的多肽更多，這些多肽在表S2的M列突出顯示。gydF4y2Ba
表2顯示53個峰與肌球蛋白相匹配，12個峰與肌動蛋白相匹配(PepI列)。51個和10個映射到肌凝蛋白和肌動蛋白的峰(Pep柱)通過了標準，判定它們適合迭代減去，因為它們映射到tryspin的末端消化產物，或錯過了具有側殘基的裂解肽，已知胰蛋白酶在裂解[20]時效率較低。因此，在計算表中排名較低的蛋白質的得分之前，將相應的質量從峰值列表中刪除。表2還列出了從初始列表開始，蛋白質將得到的分數(ScoreI)，如果所有峰值都可用。在蛋白質排名3的情況下gydF4y2Ba理查德·道金斯gydF4y2Ba和7gydF4y2BathgydF4y2Ba在表中，匹配的峰值越少，得分越高，因為剩下的峰值匹配得更精確，因此影響得分的強度加權PPM匹配平均值略低。在表2中，蛋白質名稱根據蛋白質類別進行了著色，強調點擊次數最多的蛋白質對應於肌動蛋白和肌凝蛋白亞基。表S4是表2所示PMF分析的擴展版本。它包含從每個質譜中識別出的前25個蛋白質(總共14 × 25個蛋白質，許多是多餘的)。在檢查該表中排名較低的蛋白質名稱時，很明顯，經過10輪迭代減法後，大多數排名較低的蛋白質是不正確的，因為它們不對應已知的豐富蛋白質(根據類別著色)，顯然隨機的蛋白質從密切相關的樣本開始出現。盡管如此，根據MS/MS數據，11- 25之間的蛋白質可能是正確的。表S2列出了分配給14個光譜中每一個前100個峰的序列(1400個峰匹配)。經過100輪迭代減法後，大多數峰值被映射到一個蛋白質上，但有少數峰值仍然未被分配，因為質量不能被映射到任何胰蛋白酶肽，這些胰蛋白酶肽來自一個蛋白質，至少有一個末端含有精氨酸的肽，與4ppm內的前100個質量之一匹配。每個序列對應的蛋白質用表S4中相同的方案著色。gydF4y2Ba
表2gydF4y2Ba:從一個質譜中得到的10種蛋白質含量最高的白肉樣品。gydF4y2Ba一個gydF4y2Ba等級，蛋白質鑒定的優先順序，根據列得分排序。gydF4y2BabgydF4y2BaPep，經過迭代減法後映射到峰值列表的肽的數量。gydF4y2BacgydF4y2BaPepI，映射到峰值列表的肽的初始數量，在迭代減法之前。gydF4y2BadgydF4y2Ba分數，蛋白質的分數，經過迭代減法。gydF4y2BaegydF4y2BaScoreI，沒有迭代減法的分數。gydF4y2BafgydF4y2BaPcm，與映射到蛋白質的多肽(經過迭代減去)相匹配的化學分數百分比。gydF4y2BaggydF4y2Ba皮姆，與蛋白質匹配的強度百分比。gydF4y2BahgydF4y2BaPpw，測量峰值質量與計算肽質量之間的強度加權平均PPM偏差。gydF4y2Ba我gydF4y2Ba長度，aa中蛋白質的長度。gydF4y2BajgydF4y2Ba符號，蛋白質的縮寫，與用來指定編碼蛋白質的基因的命名法有關。gydF4y2BakgydF4y2Ba蛋白質名稱，一個方便的蛋白質名稱，調整了清晰度。紅色的蛋白質名稱表示肌動蛋白或肌凝蛋白亞基;綠色為糖酵解蛋白，藍色為MS/MS證實的其他豐富的肌肉蛋白。gydF4y2Ba
為了驗證PMF蛋白鑒定的結果，並驗證我們PMF工作流程的有效性和準確性，在LC分離後收集了700多個不同的多肽的MS/MS數據。通過研究完整的蛋白質序列，14個指紋圖譜中的前10個蛋白質可以被鞏固為26個蛋白質異構體(表3)。在這26個蛋白質中，21個通過MS/MS譜驗證，基於至少3種不同的MS/MS鑒定。這21種蛋白都與豐富的肌肉蛋白(柱狀MSMS)相對應。其他5種蛋白質中的4種接近列表的底部(>=7)，並且是單一的識別，很可能是虛假的，因為它們不能被識別為豐富的肌肉蛋白質。剩下的單體鑒定是肌凝蛋白重鏈亞型(MYHg，房型)，經檢查不包含任何由MS/MS支持的肽段，而這些肽段也不是由至少一個其他肌凝蛋白重鏈引起的。因此，基於4個或更多肽的MS/MS數據支持6個肌凝蛋白重鏈，這些肽不能歸因於更小的一組肌凝蛋白重鏈序列。在14個譜中，每個譜中至少有一個MYH n端肽由PMF指定，構成4種不同的MYH異構體。從這一觀察結果可以清楚地看出，在所分析的7個雞肉樣品中，最豐富的肌凝蛋白重鏈是不同的。在肽水平上，許多但不是所有由PMF指定的肽都被MS/MS證實，並在表S2的“序列”列中以綠色突出顯示。另一方麵，正如預期的那樣，許多經MS/MS鑒定的多肽在PMF譜中沒有被正確分配(在表S2中“SequenceMSMS”一欄中以紫色突出顯示，在“結論”一欄中被標記為“不正確”或“不在數據庫中”)。 See the table S2 legend for more details regarding the relationship of PMF assignments and MS/MS identifications. Some of the peptides identified by MS/MS are not evident at all among any of the mass signals in any of the PMF spectra, presumably because they are suppressed at the level of ionization.
表3。gydF4y2Ba由PMF鑒定的鞏固蛋白。gydF4y2Ba
一個gydF4y2Ba符號，蛋白質的縮寫。由PMF(最多14個)識別出該蛋白的前10個樣本的數量。曲柄，在14個樣本中該蛋白質的最低等級。蛋白質名稱，蛋白質的常用描述性名稱。配色:紅色為肌動蛋白和肌凝蛋白，綠色為糖酵解酶，藍色為其他豐富的肌肉蛋白，不正確的識別未著色。epeptide，來自任何一個樣本的前100個肽的最大數量歸因於蛋白質的PMF。fMSMS，“*”表示通過MS/MS鑒定出該蛋白特異性肽段。gMascot，通過MS/MS獲得的任何一個肽的最高吉祥物得分。gydF4y2Ba
使用主成分分析(PCA)，我們可以確定樣本之間的可分離性，而無需考慮質量的識別。為此，我們準備了一個表，其中包含了至少3個光譜中質量一致性為15ppm的前100個質量的所有質量特征，結果得到了一個包含157個質量特征的表(表S3)，其中包括1 amu內的7對質量(見表S5)。這些質量特征中有40個在所有14個光譜中以某種強度(列N)被發現，而在另一個極端，23個在3個光譜中出現。對強度數據進行雙重歸一化處理並進行PCA分析，如方法(“1a-7b”列)所述。如圖2A所示，PCA將14個樣本清晰地分為3類:一類是白肉，另一類是截然不同的黑肉。gydF4y2Ba
PCA分析還揭示了哪些質量特征負責聚類，這是獨立於識別數據。如上所述，表S2中的許多質量已經映射到特定的蛋白質，這使得基於所提出的識別有選擇地標記質量特征成為可能。在圖2B中，通過PMF和MS/MS映射到不變的蛋白質，如肌動蛋白(11個肽，見表S3列“符號”)、肌球蛋白輕鏈(4個肽)和表達的大多數MYH異構體共享的肽(14個肽)的腫塊被組合到“ACT”類(用於肌動蛋白)，並用大黑點標記。這些多肽集中在PCA圖的中心，與預期的不變多肽一樣。與7種不同糖酵解酶(15種)中的任何一種相對應的肽用黃色表示。肌凝蛋白重鏈異構體MYHa(8個肽)、MYHb(12個肽)和MYHc(5個肽)的特異性肽分別用藍色、紅色和綠色表示。剩下的88個肽被標記為小黑點。其中一些已經被標識出來，它們都列在表S3中。表S6顯示了最容易檢測到的肌凝蛋白重鏈胰蛋白酶肽(經MS/MS分析證實)是如何在TrEMBL數據庫中可映射的10種肌凝蛋白異構體之間共享的(表S7列出)。沒有一組同源的胰蛋白酶肽具有所有這10種亞型的唯一肽序列; however, there are many peptides that are distinct between the first 3 isoforms. The table shows by color-coding how prominent the mass signal was observed in the peak lists (obtained after automated de-isotoping) derived from the seven samples and 14 PMF spectra. Cells are colored according to the intensity rank of the matched peptide; if the peptide was in the top 25, it is colored red, between 25 and 50, colored orange, between 50 and 80, colored yellow. It is clear that the 3 white meat samples nearly always have higher expression of the tryptic peptide that maps to the MYHa isoform, whereas the dark1 meat sample maps best to MYHb peptides, and dark2 meat samples map best to MYHc and d peptides. This pattern is consistent with the PCA analysis in figure 2B. There is no evidence for detection of peptides unique to the MYHe - MYHj isoforms either by PMF or by MS/MS.
圖2:gydF4y2Ba主成分分析。157個質量，m/z在800到2200之間，按質量分類到~30 ppm，並計算了14個樣品的%強度分布。空白質量/樣品元素被賦值為0.01。每個元素先按百分比歸一化，然後按樣本歸一化，再按質量歸一化。使用R對157 × 14矩陣進行PCA分析，以按樣本聚類，並將矩陣(質量對樣本→樣本對質量)轉換為按質量聚類。樣本聚類如圖2A所示。樣本被分為3組;白肉和深色肉沿PCA組分1分離，深色肉沿PCA組分2分離成2組。在基於質量的PCA分析基礎上，根據圖2B中所映射的蛋白質類別對腫塊進行過濾和著色。來自肌動蛋白和肌凝蛋白輕鏈MYLPF的幾乎所有肌凝蛋白異構體共有的29個多肽被彙集在一起，標記為“ACT”，並塗成黑色。這些多肽聚集在PCA圖的中心周圍。 Myosin heavy chain isoformspecific peptides were split into four categories; MYHa (blue, 11 peptides), MYHb (red, 7 peptides), MYHc (green, 4 peptides), MYHbc (orange, 6 peptides) and correspond roughly to the symbol column in Table S7. 15 peptides from 7 different glycolytic enzymes are marked “gly” and colored yellow. The 85 remaining masses were assigned to the category “others” whether or not they were identified by MS/MS or assigned by PMF. The category assignment of each peptide is listed in column PCA of Table S6.
PMF是對來自雞特有的白色和深色肉肌的蛋白質的胰蛋白酶消化進行的。本研究的重點是建立一個基於PMF蛋白質識別的比較蛋白質組學範式，並確定該PMF工作流在蛋白質識別和蛋白質豐度方麵的能力。為此，已編製了補充表，詳細描述了通過與類似樣品的質譜/質譜數據比較，哪些肽鑒定似乎是正確的。gydF4y2Ba
當由20-40個來自雞肌肉胰蛋白酶消化的最強峰組成的峰值列表提交到任何PMF程序時，肌動蛋白亞型很可能是最受歡迎的，因為肌動蛋白相對較小(377 aa長)且非常豐富。當啟用多個蛋白質分配時，有時也可以識別肌凝蛋白，但由於肌凝蛋白是一種更大的蛋白質(約1940 aa長)，需要更大的峰值列表來建立足夠的識別覆蓋率。傳統上，蛋白質組學研究人員認為，從整個組織消化中成功識別肌動蛋白和肌凝蛋白是PMF的全部能力，更大的峰值列表將增加假陽性識別，以犧牲正確識別為代價。然而，在這些樣本中，在每個質量的背景之上至少可以檢測到一個峰值，這意味著有可能得到一個更大的峰值列表。如何將可能重疊的同位素減少到最好的單同位素質量和強度表是一個挑戰。PMF程序VChemplex的設計目的是利用大型峰值列表中的信息，但這需要仔細調整搜索參數。最佳搜索參數的結果是樣品中已知存在的蛋白質(如肌動蛋白和肌凝蛋白)和樣品中已知數量少得多或不存在的蛋白質(如MS/MS無法識別的任何蛋白質)之間的最佳區分。優化後，搜索參數選擇的細微變化會影響結果;然而，頂部蛋白質的鑒定是穩定的各種參數值(數據未顯示)。因此，大多數參數的改變隻影響含量較低的蛋白質的鑒定。 Because peak intensity and peptide chemistry play a crucial role in protein scoring, the absolute number of peaks in the peak list has a minor impact on protein scoring. The settings listed in table S1were chosen because they produced the most credible and consistent results for all 14 samples described in this manuscript, and for other chicken muscle digest samples (data not shown).
當執行PMF搜索時，可以基於頂部蛋白質命中生成校準文件，然後用於質譜的內部校準。在我們的實驗中，基於肌動蛋白和肌凝蛋白多肽的校準模型得到了最好的結果。然後使用m/z為1790.8926的肌動蛋白肽作為一個點內校準量，將該校準模型應用於給定分析中的所有光譜。未分離蛋白質消化的典型峰值列表包含數百到1000個峰值，峰值在m/z 600到6000之間，但在本文中，研究的質量範圍在800到2200之間，導致約400個峰值(見表1)。當一個質量可以映射到4ppm以內的序列，該序列必須是一個含有精氨酸的肽，也是胰蛋白酶的最終消化產物，在由15148個蛋白質序列組成的雞數據庫中，通常隻有不到10個胰蛋白酶肽可以達到峰值。gydF4y2Ba
為了使PMF的鑒定有助於描述肌纖維類型，區分哪一種肌凝蛋白異構體[11]的含量最高是很重要的。有充分的文獻證明，許多同源異構體在使用各種蛋白質組學方法對不同動物的肌肉樣本進行鑒定的基礎上高度表達[12,14,15,20]。此外，基因芯片實驗顯示，同一塊肌肉中通常同時表達大量的肌球蛋白異構體[12,21]。這對PMF來說是一個挑戰，因為許多胰蛋白酶肽在幾個同源肌凝蛋白異構體之間共享(見表S6)。VChemplex程序旨在從未分離的蛋白質消化液中同時識別許多蛋白質，這不僅需要高質量精度，而且需要仔細注意所匹配的肽的化學性質。由於VChemplex PMF程序執行輪迭代減法，一個肌凝蛋白亞型將始終勝過其他亞型。在我們的實驗中，VChemplex程序在第1位或第2位從白肉中識別出一種特殊的肌凝蛋白重鏈亞型。這一結果主要基於三種末端胰蛋白酶消化肽，它們含有精氨酸，分別是n末端肽、從a1424開始的肽和從a1681開始的肽。後兩個多肽在PMF光譜中非常突出，足以解釋圖2中深色肉和白肉的PCA分離。這三種多肽中的兩種(n -末端和a1681)在本文分析的肌肉樣本中占主導的深色肉肌凝蛋白異構體之間也有多態性。gydF4y2Ba
有幾種方法來評估PMF鑒定的可信度。在一種方法中，當計算胰蛋白酶蛋白的肽質量時，每個蛋白都重複輸入。在第二種“移位”形式中，每個胰蛋白酶肽質量由偏移參數移位。任何與“移位”蛋白質的匹配都一定是假的。人們還可以將不合適的數據庫(如細菌)與相關物種一起搜索，以測試結果的穩健性。或者，可以將每個譜分成兩個，隻使用較低的質量進行搜索(例如，在m/z 800和1200之間)，並將搜索結果與使用m/z 1200和4000之間的質量進行比較)。在一個穩健的鑒別中，從峰值表的每一半獲得相同的蛋白質。顯然，所提出的鑒定可以通過MS/MS實驗來確證，直接或間接地遵循LC肽分離(如本文所述)。最後，因為隻有製劑中最豐富的蛋白質才能被PMF檢測到，因此提出的鑒定應該具有生物學意義gydF4y2Ba
雖然肌凝蛋白衍生肽足以解釋PCA將肌肉樣本分成三組，但顯然還有許多其他肽也起了作用，其中一些仍未確定。從圖2B中可以明顯看出，大部分來自糖酵解酶的肽在白肉樣品中表現突出，這是快速肌肉纖維[22]的特點。令人驚訝的是，肌紅蛋白(MB)通常被認為是造成深色肉和白肉[16]之間顏色差異的原因，但PMF沒有檢測到。MB有三種含精氨酸的胰蛋白酶肽(它們都是通過MS/MS檢測到的)，即使仔細檢查，它們在任何PMF光譜中都不明顯。因此，肌紅蛋白似乎不夠豐富，無法通過未分離的整個肌肉消化的指紋檢測到。雖然在此檢測的樣本數量很少，但有證據表明其他幾種蛋白質的差異表達;例如，通過PMF和MS/MS數據映射，絲敏C隻在白肉中檢測到，而肌酸激酶s型、肌酸激酶(CKMT2)和熱休克蛋白B1似乎在深色肉的“暗2”樣本中富集。這可能與特定的肌凝蛋白重鏈使用(異構體c和d)密切相關。使用本文描述的技術從單個肌肉纖維開始進行PMF分析將是有趣的，這些肌肉纖維經過電生理分析來證實這種觀察。gydF4y2Ba
PMF在進行這種分析時的另一個限製是質譜儀的分辨率。這裏使用的質譜儀原型能夠產生典型質量分辨率約為35000的質譜。使用分辨率較低的SimulTOF 2000質譜儀進行的實驗表明，PMF仍然可以識別與這些實驗中確定的相同的肌凝蛋白重鏈，但由於未確定的母塊，它變得明顯更難識別含量較低的蛋白質。顯然，經典的蛋白質組學方法使用廣泛的肽分離和同位素富集策略、多重反應監測策略或2d凝膠電泳，可以更準確地量化更多數量的蛋白質。然而，這些策略需要仔細注意樣品製備的可重複性，而且既耗時又昂貴。這裏使用的策略對於製定更仔細的蛋白質組學分析的方案以及篩選需要額外注意的樣本是理想的。gydF4y2Ba
在檢查表S4中所示的PMF所提出的鑒定結果時，很明顯，PMF通常能夠正確地識別肌肉中的10種蛋白質。在肽水平，PMF正確地占表S2中1400個質量中的787個。在381例病例中，MS/MS尚未鑒定出任何肽可以解釋峰值，因此這些腫塊在表S2的MSMS列中被標記為“未知”。從表S4可以清楚地看到，一些強質量信號從未被PMF正確分配，其中一些也從未被MS/MS識別。這至少有兩個主要原因。一個問題是意料之外的化學修飾。在這些實驗中，我們改變了肌動蛋白和肌凝蛋白(以及其他一些蛋白質)的序列，以便VChemplex程序能夠識別已知的N端修飾和已知的組氨酸甲基化位點。在MS/MS裂解後，這些多肽在m/z 124處產生一個強甲基組氨酸免疫離子峰(數據未顯示)。這些修飾似乎都是幾乎構成的，因為沒有發現未修飾的肽。相應的修飾肽之前在一個更大的人類肌肉蛋白質組學分析中遇到過，其中數據是使用電噴霧[20]通過MS/MS獲得的。 Therefore, these modifications appear to be conserved between chickens and humans. Another interesting modification is trimethylation of a lysine residue in myosin, resulting in ATDTSFK(42.046)NK at m/z 1053.557, which is conserved at the tryptic peptide level in 12 different human myosin heavy chains in Swiss-Prot. As it happens, there is a second plausible conserved myosin peptide that can account for nearly this same mass (RHLEEEIK with m/z 1053.5694), which was not identified by MS/MS among the limited amount of MS/ MS spectra that we acquired. Thus, in this case, PMF mapped this peak to the right protein for the wrong reason. As it turns out, there are only 9 cases of ambiguous mass bin assignments that could match to two distinct terminal arginine containing peptides that were confirmed by MS/MS (Table S5). As a final informatic complication, in some muscle samples (perhaps adjacent to tendon), collagen may well be sufficiently abundant so that some hydroxyproline-containing peptides could explain unidentified masses.
從MS/MS數據可以明顯看出，TrEMBL雞數據庫缺少一些關鍵蛋白，包括在肌肉中非常豐富的果糖二磷酸醛縮酶、糖原磷酸化酶和碳酸酐酶的某些亞型的完整版本。其中許多蛋白質在脊椎動物物種中高度保守，因此MS/MS識別的多肽與人類和其他哺乳動物共享，因此在搜索脊椎動物數據庫時，Mascot也識別出了這些多肽。除了這些經過充分研究的酶外，肌肉組織還表達一些非常大的蛋白質，如肌肽(33423 aa長)和星雲蛋白(6669 aa長)，這可以解釋許多信號。肌提蛋白、肌凝蛋白和其他豐富的蛋白質，如原肌凝蛋白，也有廣泛的差異拚接。TrEMBL雞蛋白質組不包括這些剪接變體的完整序列。根據早期遺傳學數據，最初認為雞肌凝蛋白重鏈基因[23]多達31個，但骨骼肌肌凝蛋白基因[13]可能不超過10個。從成年雞快肌[12]中分離到至少5個不同的肌球蛋白重鏈基因。在這一點上，尚不清楚是否所有相關的肌凝蛋白異構體都忠實地代表了雞的蛋白質組。在這篇稿子準備的過程中，雞的蛋白質組可能已經做了一些改進。gydF4y2Ba
在某些情況下，在PMF譜中突出的質量似乎在肽分離後不突出。還需要進行更多的工作，以確定這種通信的缺乏是否可以掩蓋額外的信息限製。在至少4個質譜中發現了39個質量團塊，與MS/MS鑒定的任何肽段不匹配10 ppm。gydF4y2Ba
LC分離後，MS/MS從豐富的肌肉蛋白(如肌動蛋白和肌球蛋白)中檢測到少量的半加密肽，但它們也不對應於未識別的峰。大多數這些腫塊也沒有被PMF在任何級別上映射到經MS/MS鑒定證實的任何蛋白質。綜上所述，這些觀察結果表明，在未分離的胰蛋白酶消化體中仍有許多峰值可以很容易地觀察到，但尚未加以解釋。gydF4y2Ba
上述討論解釋了為什麼從雞肌肉的胰蛋白酶消化開始，PMF還不可能得到所有的正確答案。盡管如此，可以重複測量的質量仍然可以用於分類，使用無偏倚的方法，如PCA分析。如上所述，許多可以識別的腫塊可以很容易地與區分肌肉纖維的通路相關聯。gydF4y2Ba
這裏收集的有限數據清楚地描述了雞的三種不同類型的肌肉組織。通過研究更多的樣本，應該有可能確定有多少其他種類的肌肉可以區分。這些數據可以確定哪些肌凝蛋白重鏈在特定肌肉中表達，特定肌肉的特定區域，或與動物的年齡相關，或在個體動物之間有很大差異。在人類中，大多數骨骼肌包含慢收縮肌和快收縮肌的混合物。在許多疾病中，有向慢收縮肌的轉化，也有肌凝蛋白重鏈的表達增加，這些重鏈大多在出生前或出生後不久表達。還有專門控製眼睛和吞咽運動的骨骼肌。心肌組織和平滑肌中表達的肌球蛋白基因差異較大。大量的工作已經完成，在RNA水平上描述了在少量樣本的表達模式的細節。由於它的簡單性，這裏所描述的方法應該適合於描述大量的樣品，並且可以應用於許多不同的組織和生物體。gydF4y2Ba
PMF能夠快速識別和提供半定量信息，多達十個豐富的蛋白質從未分離的胰蛋白酶消化組織。有可能區分不同組織特有的豐富蛋白質的異構體，如肌凝蛋白。因此，我們建議使用PMF對組織樣本進行分類。gydF4y2Ba
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引用:gydF4y2BaParker KC, Du J, Hattan SJ(2016)利用雞白肉和深色肉胰蛋白酶消化肽質量指紋識別肌球蛋白重鏈異構體的使用。生物化學分析研究2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.107gydF4y2Ba
版權:gydF4y2Ba©2016 Parker KC.這是一篇基於創作共用署名許可條款發布的開放獲取文章，該許可允許在任何媒體上不受限製地使用、發布和複製，前提是注明原作者和來源。gydF4y2Ba
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