摘要

抗原抗體親和力的測定在生物療法的發展中至關重要。然而，需要高通量的方法對生理相關和複雜的基質，如幹淨的血清或血漿進行親和分析。我們利用中觀尺度發現技術(MSD-SEA)建立了一種通過溶液平衡分析測定幹淨血清親和力的高通量方法。本文介紹了carlumab (CNTO 888)的分析結果，carlumab是一種抗ccl2的中和抗體，它與靶標具有高親和力。采用表麵等離子體共振法(SPR)、動力學排除法(KEA)、等溫滴定量熱法(ITC)和MSD-SEA測定了carlumab對PBS中CCL2的親和力。用MSD-SEA法測定carlumab對血清中CCL2的親和力。SPR、KEA和ITC的結果與MSD-SEA的結果一致。重要的是，在PBS中得到的結果與在整潔的人血清中得到的結果一致。這項工作展示了msd技術作為清潔血清溶液平衡親和測定工具的使用，並強調了其在利用生理相關條件對高親和治療候選者進行HTP分析的潛力。

關鍵字

CCL2;抗體;Carlumab;親和力;Biacore;ProteOn;KinExA;默沙東公司;血清

縮寫

CCL2: cc趨化因子配體2;D-PBS:杜爾貝科磷酸鹽緩衝鹽水;ITC:等溫滴定量熱法;KEA:動力學排除法;K_D:平衡解離常數;k_在:關聯速率常數;k_從:解離速率常數;MSD:中觀尺度發現;MSD- sea:用MSD技術測定溶液平衡親和度;俄羅斯:響應單位;表麵等離子體共振。

簡介

生物治療發展的進步要求應用分析方法，以選擇提供最佳治療價值的候選者。候選治療藥物的親和力可能與其治療價值密切相關，因為已有研究表明，抗體-抗原相互作用親和力的提高可能導致藥效的提高[1,2]。因此，大量的努力被用於獲得高親和力抗體[1,3,4]，即使在親和力和活性之間存在負相關關係的情況下，如某些激動性EPOR抗體[5]。基於親和力的候選抗體的選擇可能具有挑戰性，因為在許多治療領域，在皮臼齒和亞皮臼齒範圍內，發展出極高親和力的抗體的趨勢;因此，親和性測量需要適合於高親和性相互作用的方法。分析在生理相關條件(或複雜基質)中的親和性也很重要，因為它說明了血清成分的存在，可能會潛在地改變抗體與其抗原的相互作用。在這些條件下的分析還可以研究抗原在其自然環境中的相互作用，以及在保留功能和生物物理特性的重要因素存在的情況下。

親和力分析最廣泛使用的技術包括Biacore和ProteOn(表麵等離子體共振)、Octet(生物分子層幹涉法)、KinExA(動力學排除法)、ITC(等溫滴定量熱法)和Scatchard a分析(放射免疫分析法)等方法[6-12]。這些是確定廣泛的親和性(M - sub-pM)的強大工具，盡管每個都有局限性。這些限製包括靈敏度或通量的限製，需要固定或標記其中一種交互作用(如使用放射性材料)，與複雜樣品基質或其組合的不相容性。幾個研究小組已經致力於開發方法來克服其中一個或多個限製。2012年，Salimi-Moosavi等人發表了一種無標簽、無固定化方法的開發，該方法保留了KinExA方法的靈敏度，並克服了SPR或ITC等其他一些方法的靈敏度限製。該技術是一種利用Gyrolab儀器[14]微流體平台的溶液平衡親和(SEA)方法，與KinExA[13]相比，該方法的分析吞吐量提高了10倍。使用MSD儀器對fab的HTP結合分析也開展了其他工作[15,16]。最近，Estep等人對這一概念進行了改進，並發表了他們的研究成果，即使用Meso Scale Discovery (MSD)儀器作為溶液平衡親和度測量的檢測平台。他們證明了這種無標簽方法對候選抗體HTP親和力分析的適用性，提供了比Salimi-Moosavi等人報道的方法更高的通量。[13]。Estep等人發表的方法[17]比Haenel等人使用BioVeris儀器(已不再上市)開發的方法[18]更靈敏，或以前描述過的其他HTP方法[19]。 Measuring affinity in complex matrices such as high concentrations of serum remained one of the most severe limitations of affinity determination until recently, when Bee et al. [20] applied KEA for the analysis of samples in serum [20]. In addition to the studies performed by KEA, others have shown advances using backscattering interferometry [21,22] for working with neat serum (personal communication). In this work we describe a method that combines the high throughput capability of MSD to determine SEA as demonstrated by Estep et al. with tolerance to neat serum and demonstrate its application to the analysis of carlumab binding to CCL2. CCL2 (CC-chemokine ligand 2), is a chemokine which induces calcium mobilization and chemotaxis upon binding to its receptor (CCR2, a G-protein-coupled receptor) [23]. CCL2 has been implicated in inflammatory diseases [24] and cancer [25-28]. Carlumab is a human antibody that entered clinical trials for oncology [29]. It was noted in the trial that carlumab briefly suppressed free CCL2, but this effect was not sustained with dosing. Due to lack of single agent efficacy, development of the drug was discontinued. One of the approaches taken to investigate these observations was to compare the affinity of the antibody in PBS versus neat sera to determine if the interaction of carlumab with CCL2 was affected by the presence of serum. In this exercise it was important to keep serum as unaltered as possible to perform the analysis in the most relevant conditions.

我們在這裏報道了卡魯馬在人血清中的親和力測定和我們開發的方法來實現這一目標。我們將MSD-SEA (Meso Scale discovery technology solution balance affinity analysis using Meso Scale discovery technology)方法所得結果與表麵等離子體共振分析(Biacore和ProteOn)、動力學排除分析(KinExA)和等溫滴定量熱法(ITC)所得數據進行了比較。MSD-SEA實驗在PBS或幹淨的人類血清中進行。Biacore、KEA和ITC在PBS中的親和結果與MSD-SEA的結果一致。重要的是，在人血清中得到的結果與PBS中的結果一致，表明carlumab在兩種基質中都對CCL2保持了較高的親和力，而缺乏療效不是由於在血清中親和力降低。這項工作展示了msd技術作為複雜基質溶液平衡親和性測定的檢測平台，使得以HTP格式分析生理相關液體中的相互作用成為可能，而不需要標記反應物

材料和方法

材料

針對人CCL2的單克隆抗體(carlumab)是根據Carton和合作者[30]的描述生成的，並使用不同的細胞係在公司(Centocor R&D)製備。如前所述，carlumab抗原結合片段(Fab)生成[30-32]。重組CCL2，以BSA為載體(或無載體的KEA珠製備和生物素化)從R&D Systems Inc. (cat# 279-MC/CF)獲得。親和純化的吲哚二碳菁(cy5)標記山羊抗人抗體(H+L)和山羊抗人IgG Fcγ片段特異性抗體(目錄編號109-005-098)來自Jackson Immuno Research laboratories Inc.。在公司(Centocor R&D)製備和標記抗獨特型(抗id)。CNTO402 (C1767A，人IgG1抗卡魯布抗體)被生物素化，CNTO6707 (C1766，人IgG1抗卡魯布抗體)被釕標記。MSD Read Buffer (Cat # R92TC-1)和MSD Streptavidin Standard plate (Cat # L11SA-1)來自Meso Scale Discovery。阿茲內酯激活珠(Cat# 53111)和PBS中的SuperBlock®阻斷緩衝液(Cat# 37515)來自Pierce Biotechnology。傳感器芯片胺、偶聯試劑和表麵活性劑P20從(Biacore AB;目前屬於GE醫療集團)或Bio-Rad。 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS), pH7.4, from Invitrogen Corporation (cat# 14190). Human serum was obtained from Bioreclamation Inc. IgG1 from human myeloma plasma was obtained from Sigma (cat# I5154).Other reagents were, bovine serum albumin, fraction V (Sigma, A3059-100G), Tween 20 (Sigma, P1379). MSD Assay and blocking buffer: 10 mM phosphate buffered pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mg/mL (1%) BSA, 0.05% Tween 20. MSD wash buffer: 10 mM phosphate buffered pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20. MSD Read Buffer (Meso Scale Discovery, R92TC-1), MSD Streptavidin Standard plate (MSD, L11SA-1) were obtained from Meso Scale Discovery. Other equipment and consumables was a Tecan plate washer or BIO-TEK automated plate washer with stacker, sample plate (Greiner 651201, 0.3 mL v-bottom).

Biacore在PBS緩衝液中的表麵等離子體共振(SPR)實驗

使用Biacore 3000光學生物傳感器(Biacore AB;目前屬於通用電氣醫療集團)。利用製造商的氨基偶聯化學說明，將山羊抗人IgG Fcγ片段特異性抗體偶聯到CM-5傳感器芯片的羧甲基化葡聚糖表麵，製備生物傳感器表麵。耦合緩衝液為10 mM醋酸鈉，pH為4.5。在每個反應和參考流池中捕獲約1800 RU的Ab。

動力學實驗在25°C的PBS(含0.005%表麵活性劑P20和3 mM EDTA)中進行。PBS在使用前被過濾和脫氣。製備了5個CCL2係列稀釋劑，稀釋範圍從5 nM到60 pM。流速為1 μ g/mL時，在流細胞2或流細胞4上可捕獲約95 RU的carlumab。用抗fc抗體修飾但缺乏carlumab的流式細胞作為參考。捕獲carlumab後，以60µL/min的速度注射CCL2 240µL(締合相)，隨後900或1800秒的緩衝流(解離相)。用20 μ L注入100 mM H再生芯片表麵_3.阿寶₄然後20µL注射50 mM NaOH, 60µL/min。對於數據處理，使用1.1 g的Scrubber軟件(BioLogic software)對數據進行雙參考減法，以糾正緩衝對信號和儀器噪聲[33]的貢獻。在初始數據處理後，使用BIA評價軟件4.0.1版本(Biacore, AB)使用Langmuir 1:1綁定模型對數據進行動力學分析。

血清表麵等離子體共振(SPR)實驗采用Biacore和ProteOn

血清SPR實驗使用Biacore或ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad)進行。製備了兩種生物傳感器表麵。第一種是通過將carlumab直接共價固定在傳感器表麵製備的。第二個表麵是通過將山羊抗人IgG Fcγ片段特異性抗體共價固定到CM-5芯片(用於Biacore)或GLC傳感器芯片(用於ProteOn)的表麵，使用製造商的胺偶聯化學說明。耦合是按照上一節中描述的條件執行的。

動力學實驗在25°C下進行，使用流動緩衝液(PBS pH 7.4含有0.005%表麵活性劑P20和3 mM EDTA)。CCL2在運行緩衝液或清潔血清中製備。運行中的緩衝液在使用前經過過濾和除氣。用抗fc抗體修飾的表麵，在一個流動細胞或通道中捕獲了約95 RU的carlumab。Carlumab捕獲後，從骨髓瘤血漿中注射人IgG (Sigma, cat # I5154)。CCL2被注入到含有捕獲或共價固定的carlumab的傳感器芯片上。通過以60µL/min的速度注射240µL的5 nM CCL2來監測這種關聯，並監測分離時間為1800秒(緩衝流)。用20 μ L注入0.85% H再生芯片表麵_3.阿寶₄，在100 μ L/min時。數據處理使用製造商的ProteOn軟件或1.1g版本的Scrubber軟件(BioLogic software)。

等溫滴定量熱法

恒溫滴定量熱(ITC)實驗使用VP-ITC微量量熱計(Microcal Inc.)在20.8℃下，20 mM MES緩衝液，pH 6.0，含100 mM NaCl。滴定時將20µM CCL2的18µL等分注入carlumab Fab的2µM溶液中。對每次注射下的麵積進行積分得到反應熱。由於稀釋的影響，對反應熱進行了校正。儀器采用製造商推薦的標準程序進行校準，並將1mm HCl滴定為10mm Trisbase (Sigma, Co)。使用Origin軟件V7.083 (Origin Lab Corporation)分析數據，並擬合到一個單位點綁定模型。

動力學排除試驗(KEA)

動力學排除試驗采用KinExA 3000儀器(Sapidyne Instruments)進行。平衡實驗在RT條件下進行，使用1:1稀釋的PBS和超塊阻塞緩衝液(在PBS中)作為緩衝液。CCL2的工作濃度分別為766.7、187.0、47.9、7.48、0.75和0.037 pM, carlumab的工作濃度為15 pM。抗原/抗體樣品在37°C條件下孵育4小時，然後在rt條件下孵育13小時，使其達到平衡。為了檢測遊離carlumab，將平衡的樣品裝入由ccl2修飾的azlactone活化珠柱製備的KinExA 3000流式細胞中。用Cy5標記的山羊抗人(H+L)抗體檢測平衡樣品中與小珠結合的遊離carlumab。實驗是重複進行的。使用KinExA Pro軟件1.0.3版本(Sapidyne Instruments)將數據擬合到1:1綁定模型中。

PBS與血清的MSD-SEA實驗

使用MSD儀器進行溶液平衡親和性測定(MSD- sea法)，方法是將樣品稀釋在緩衝液或純淨血清中，製備配合物的方法與使用KinExA儀器製備KEA實驗用的配合物類似。然而，遊離單抗的檢測是使用MSD閱讀器(MSD Sector Imager 6000TM reader)進行的。

在96孔聚丙烯樣品板中製備了連續稀釋CCL2的整齊血清或緩衝液(10 nM至0.01 pM, 4倍稀釋係列)。陰性對照包含無抗體或抗原的緩衝液或血清，陽性對照包含無抗原的抗體。當樣品在緩衝液中製備時，緩衝液(MSD測定和阻斷緩衝液)由10 mM磷酸鹽緩衝液pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mg/mL 1% BSA, 0.05%吐溫20組成。Carlumab在20,40或60pm時也在純血清或緩衝液中製備。將每個恒定濃度的carlumab等量(50µL)混合到每個CCL2濃度;因此，最終濃度是上述濃度的一半。樣品通過短暫搖動平板混合，在4°C恒溫旋轉24或48小時後達到平衡。重複的混合物在恒溫或不恒溫的情況下孵育。孵育後，用電子化學發光免疫測定法(ECL)檢測平衡混合物中未結合(遊離)的carlumab。

為了檢測遊離carlumab，在分析前一天準備了檢測板。將MSD Streptavidin標準板與分析緩衝液阻塞5分鍾，然後加入200 ng/mL生物素化CNTO402 (C1767A;中和抗獨特型抗體(抗-id)在測定緩衝液中，然後在4°C孵育約18小時。檢測時，加入150 μ L/孔的檢測緩衝液，不去除包覆捕獲試劑，室溫孵育1小時。然後用洗滌液進行5X洗滌。將50 μ L/孔的carlumab/CCL2混合物轉移到檢測板上孵育30分鍾，使遊離carlumab捕獲到生物素化的CNTO402 (C1767A)上，然後用Wash Buffer洗滌3次。每孔0.26 μ g/mL加入標記CNTO6707 (C1766A)的釕，孵育1 h。洗淨培養皿，每孔用150 μ L的MSD Read Buffer(1:4的原液加入去離子化的H₂O)補充道。在MSD Sector Imager 6000TM Reader上立即讀取這些平板，以檢測發光水平。數據分析使用GraphPad Prism軟件5版本(GraphPad software Inc.)。原始數據歸一化使用Prism歸一化函數定義從0%到100%遊離抗體的曲線，使用緩衝或整齊的血清控製信號(無carlumab，無抗原)作為100%抗體邊界。歸一化數據擬合到非線性回歸分析曲線，以確定抗體對抗原的親和力。Prism中輸入了一個用戶定義的方程，該方程由Guldberg和Waage[36]最初描述的動態平衡質量作用定律[18,34-36]生成，並由其他人重新研究了幾個係統[18,34-36]。

結果

用Biacore分析緩衝液的動力學

采用Biacore進行SPR實驗，測定了carlumab在PBS緩衝液(PBS, 0.005% P20和3 mM EDTA, pH 7.4)中對CCL2的親和力。圖1顯示了carlumab的典型Biacore綁定剖麵，包括收集30分鍾的解離數據，提供至少5%(>20%)的響應衰減，這是精確確定解離速率常數[37]所需要的。對來自5個不同表達係統的carlumab樣本進行了分析。來自細胞係SP2/0的Carlumab被用作對照，以解釋流式細胞2和流式細胞4之間的任何潛在差異。表1總結了親和力的結果(K_D)和穩定性(k_d)由五種不同的carlumab和CCL2樣品所形成的配合物的Biacore測定。K_D值從23到38 pM，這表明CHO-C1463A表達的樣本與其他4個細胞係(特別是SP2/0)相比具有更強的平均親和性。然而，流式細胞2和流式細胞4中SP2/0的標準差和數據比較表明，在這些細胞係中產生的carlumab親和力之間可能沒有顯著差異。這些結果表明carlumab在PBS中與CCL2結合具有較高的親和力，且親和力受表達係統差異的影響最小。

Carlumab細胞行	流細胞	k一個(M－1年代－1）	kd(年代－1）	KD(pM)
CHO-C1463A	2	(10.1±0.10)× 106	(2.47±0.68)× 10-4	25±7
CHO-C1493A	4	(9.09±0.99)× 106	(2.58±0.15)× 10-4	28±4
CHO-C1494A	2	(9.14±0.27)× 106	(2.08±0.38)× 10-4	23±8
hek - 293	4	(9.21±0.75)× 106	(2.52±1.11)× 10-4	38±12
SP2/0	2	(10.1±0.17)× 106	(2.81±0.54)× 10-4	28±7
SP2/0	4	(7.76±0.13)× 106	(2.97±0.79)× 10-4	38±12

表1。Biacore結果:carlumab與CCL2相互作用的動力學和親和數據。樣品carlumab SP2/0在Flow cell 2和Flow cell 4中被捕獲，以解釋由於樣品通過Flow cell的順序流動而產生的任何差異。所示的是在大多數情況下注射三份樣品的三個不同e×periments的平均參數和相應的標準偏差。使用了兩個傳感器芯片。

等溫滴定量熱法(ITC)證實了SPR結果，並確定了緩衝液中carlumab-CCL2相互作用的化學計量學

采用等溫滴定量熱法(ITC)對carlumab與CCL2的結合進行了表征，以深入了解驅動相互作用的力量，並確認Biacore估計的化學計量。在皮摩爾範圍內，ITC通常不是確定親和力的選擇方法;然而，它是化學計量測定的最佳技術。ITC數據顯示carlumab Fab以1:1的配體化學計量法與CCL2結合:Fab(圖1b)證實了Biacore獲得的化學計量法。盡管結合作用超出了精確測量親和度的ITC極限，如結合曲線中非常急劇的轉變所示，結果證實親和度是亞納摩爾的。此外，通過ITC[38]可以直接準確地測量焓的變化(ΔH)。觀察到CCL2的-7.9±3.5千卡/摩爾焓的負變化，表明在25°C時，焓有助於推動相互作用。研究表明，焓貢獻來源於蛋白質-蛋白質、蛋白質-溶劑和溶劑-溶劑氫鍵網絡的變化、鹽橋的形成和範德華接觸點[39]的變化。負ΔH主要歸因於h鍵和鹽橋[39]等特定的相互作用。這裏提供的數據表明，這種分子力驅動carlumab和CCL2之間的相互作用。 This is in agreement with the results obtained by X-ray crystallography, which revealed that basic residues such as arginine are involved in the complex formation, forming several hydrogen bonds between the antibody and the antigen [31]. The antigen-antibody interphase also includes van-der-Waals interactions [31], that together with salt bridges and hydrogen bonds are the forces driving the binding leading to a negative ΔH.

圖1:Biacore和ITC實驗。典型的Biacore傳感器圖，用於人體CCL2對carlumab的動力學滴定(A)，以及收集30分鍾的解離相數據(B)。固體平滑線對應於一個簡單的1:1結合模型的擬合。ITC數據顯示CCL2與carlumab Fab的結合熱(C)和反應熱歸一化為注入CCL2的摩爾數，並根據稀釋熱(D)進行了校正。實線是將數據擬合到單一位點模型的非線性最小二乘。

KEA無標記溶液平衡實驗證實了緩衝液中抗原-抗體相互作用的SPR結果

為了驗證SPR得到的親和性，采用動力學排除法(KEA)進行了溶液平衡親和(SEA)分析。KinExA已被公認為一種使能技術，允許研究高親和相互作用(pM和次pM)，包括那些非常快的通速(>10⁷米^－1年代^－1)，速率低於10⁵年代^－1[8]。KEA是一種基於熒光的高靈敏度方法，Darling和Brault等[8,9]對其進行了詳細的描述。為了測定carlumab與CCL2在溶液中的親和力，我們製備了含有固定濃度的carlumab和CCL2連續稀釋的混合物。混合物孵育超過12小時以達到平衡。將培養的混合物通過充滿ccl2修飾小球的KinExA細胞，並使用熒光標記的抗人抗體檢測珠結合的卡魯布(反應混合物中的遊離卡魯布)，從而檢測遊離卡魯布。表2 (K_D)給出了carlumab和CCL2五個不同樣品形成絡合物的KEA結果。KEA數據證實了Biacore獲得的結果，在下午17點到下午63點之間有親和力。如在Biacore中所見，CHO-C1463A中表達的carlumab與其他細胞係中表達的carlumab相比，具有2倍的親和力。

Carlumab細胞行	KD(pM)	95%置信區間
CHO-C1463A	17	5-36
CHO-C1493A	63	45 - 86
CHO-C1494A	12	地位
hek - 293	40	32-48
SP2/0	38	35-41

表格2.用KEA法得到了carlumab與CCL2相互作用的平衡解離常數

用Biacore和ProteOn對血清進行動力學分析

SPR實驗(使用Biacore或ProteOn技術)的目的是確定carlumab與CCL2結合的動力學和親和力是否因血清成分的存在而改變。由於增加了非特異性蛋白結合和大量參考文獻減法問題，在整潔血清中進行這些實驗預計會使SPR分析複雜化。然而，由於SPR提供了更高的吞吐量，並已被證明可以在較低濃度的血清中工作[40,41]，開發SPR方法被認為是值得的努力。為了更好地模擬Biacore中用於上述PBS實驗的條件，我們使用Biacore進行的血清實驗涉及用抗fc抗體捕獲carlumab。這種方法的一個困難是血清中存在人免疫球蛋白;因此，在捕獲carlumab後，通過注射飽和水平的純化血清IgG1抗體來阻斷抗人fc修飾的傳感器表麵。關於相互作用中血清成分的潛在影響的另一個問題是，高濃度的carlumab(在患者高劑量的情況下)是否會改變相互作用。考慮到已知的分子與傳感器表麵固定分子的相互作用，這是違反直覺的;然而，這是一個有效的問題，因為血清對卡魯布親和力的潛在影響是有問題的，因為觀察到，隨著卡魯布[29]的持續和增加劑量，遊離CCL2比預期更多。為了回答這個問題，我們使用了3種不同級別的carlumab捕獲，範圍從16到620 RU。 The effect of the different RU levels of carlumab was tested first in PBS by injecting 5 nM CCL2 and observing the dissociation for 30 minutes. The data revealed that in PBS the increase in surface concentration of carlumab did not result in an increase in dissociation rate (data not shown). At 159 RU, 321 RU and 618RU of carlumab immobilized onto the surface the dissociation rate was 2.79 x 10⁴年代^－1， 1.49 x 10⁴年代^－17.70 × 10⁵年代^－17.70 (7) × 10⁵年代^－1分別表示相互作用趨於穩定而不是相互作用減弱的趨勢。實驗結束後，在幹淨血清中注入5 nM CCL2。在Biacore的實驗由於儀器堵塞和高非特異性結合而失敗。實驗繼續使用ProteOn儀器進行，該儀器提供了更高的吞吐量(可以同時測試不同的條件)、不同的流體和不同的傳感器矩陣。在ProteOn中，我們通過在傳感器表麵使用不同的點同時通過Fc和共價固定的carlumab來測試carlumab捕獲。

為了製備ProteOn傳感器表麵抗人Fc抗體，在水平方向(A4-A6)上固定(~ 6000 RU)，在垂直方向(L4- L6)上固定(35 ~ 6000 RU)，從而得到抗Fc和carlumab的混合物(A4-A6 × L4-L6)。雖然這些混合點不能使用，但我們也獲得了6個空白點(A1-A3 x L1-L3)，可以作為參考(圖2a)。Carlumab在兩個抗fc表麵被捕獲(100-400 RU)，一個被保留以供參考。為了通過控製血清成分的非特異性結合來改善Biacore中使用的條件，並避免carlumab表麵被任何內源性CCL2預飽和，carlumab Fab在100 nM(濃度>>K)下添加_D這種血清製劑有幾個功能，在注射CCL2添加的血清之前，用血清成分(IgG和其他成分)飽和表麵，以避免任何內源性CCL2使carlumab表麵飽和，作為雙參考對照，並在參考表麵捕獲非相關抗體，以便更好地參考。

共價固定carlumab的量從~35 ~ ~6000 RU不等(從SPR上通常使用的最低捕獲量到這種情況下芯片的最大結合容量)。6000 RU是PBS實驗中Biacore通常使用的捕獲量的75倍。

carlumab捕獲並用carlumab處理過的血清處理傳感器芯片後，在幹淨血清中注入5 nM CCL2(在Biacore實驗中觀察飽和濃度)。注射後，在PBS運行緩衝液中監測解離相30分鍾。數據顯示，在PBS中CCL2與carlumab結合的脫除率與人血清(2.02 × 10⁴年代^－1；圖2 b)。因此，我們得出的結論是，與PBS相比，分離率的變化不是導致血清中carlumab與CCL2結合的潛在減少的因素。仍有可能是由於通速的不同而引起親和度的不同。然而，在這些實驗中，由於引用無效，如圖2B中標有“assn”的部分所示，關聯階段無法用於確定關聯。雖然可以得出結論，血清對carlumab-CCL2相互作用的解離率沒有影響，但關於聯想率的問題仍然沒有答案。

圖2:純血清中的蛋白質。(A) ProteOn傳感器表麵圖，顯示水平方向上的抗人Fc抗體(A4-A6)，垂直方向上的固定卡隆抗體(L4-L6)，不可用的(A4-A6 x L4-L6)上的抗Fc和卡隆抗體的混合物，(A1-A3 x L1-L3)上的空白點作為共價固定卡隆抗體的參考。(B)將5 nM CCL2注射到整潔血清的2個不同表麵(“assn”相)的傳感圖，然後監測解離相。通過向非CCL2添加的血清中注射100 nM加入carlumab Fab(以避免任何內源性CCL2 carlumab對carlumab表麵的預飽和)的幹淨血清，控製血清成分的非特異性結合後，獲得這些傳感器圖。

MSD-SEA結果表明，清潔血清中carlumab對CCL2的親和力保持不變

與最近的出版物[17]一致，我們的工作表明MSD平台可以用於分析緩衝區中的高親和相互作用。為了確定血清成分是否影響carlumab對CCL2的親和力，以MSD閱讀器為檢測平台，采用(MSD- sea)方法進行溶液平衡親和力分析。為了進行分析，配合物的製備方法與KEA相似，但檢測是使用電化學發光法(ECL)，使用抗獨特型抗體作為捕獲和檢測試劑。使用的體積為每個樣品50µL，共100µL的反應混合物。在平衡反應混合物後，將50µ的L轉移到塗有生物素化抗蟲素的鏈黴親和素(SA) MSD板上，以捕獲遊離的卡氏贅。當這些檢測板被檢測緩衝液阻塞，與捕獲抗id在4℃下孵育18小時，並被檢測緩衝液(含有牛血清白蛋白)阻塞，然後用於捕獲遊離carlumab時，可獲得更好的結果。捕獲的carlumab使用不同的反id檢測，如圖3A所示。捕獲遊離的carlumab，在這一步之後，加入釕標記的抗id試劑並孵育1小時，然後使用MSD Sector Imager 6000TM Reader進行清洗和檢測。

為了擬合親和性數據，我們在GraphPad Prism軟件中引入了一個用戶定義的方程。這個用戶定義的方程是由[34]中最初描述的動態平衡的質量作用定律生成的，其他人對幾個係統重新進行了研究[18,35,36]。在擬合親和度之前，使用Prism歸一化函數將原始數據歸一化，使用緩衝或整齊的血清控製信號(無carlumab，無添加抗原)作為100%抗體綁定，定義從0%到100%遊離抗體的曲線。通過使用Haenel及其合作者和Piehler及其合作者[18,36]描述的用戶定義方程進行非線性回歸分析曲線擬合，對歸一化數據進行擬合。在未添加重組CCL2的幹淨血清中，carlumab的信號處於100%遊離carlumab達到的平台水平，說明血清中未檢測到內源性CCL2對carlumab的結合有影響。圖3B和3C顯示了PBS緩衝液和整齊血清中carlumab與CCL2的結合圖譜，而表3顯示了K_D由MSD-SEA測定。除了親和性，表3顯示了用於評估擬合優度的參數。表中顯示R方值>0.98，標準誤差<10%，表明數據被用戶定義的方程很好地描述。最後，PBS和純血清的三個測量值的標準差分別為12%和22%，表明PBS和血清中數據的重現性良好。MSD-SEA數據(表3)與在PBS緩衝中獲得的KinExA和Biacore數據(表1和表2)非常一致。重要的是，MSD-SEA數據顯示carlumab在整齊的人血清中對CCL2的親和力與在PBS中的親和力相同，約40 pM。

樣品後來×	KD(pM)	R平方	標準錯誤	95%置信區間
美國公共電視台	48.1	> 0.98	9.5	29 - 67
美國公共電視台	42.5	> 0.98	3.9	35-51
美國公共電視台	37.3	> 0.98	6.4	25 - 50
平均	42.6±5.4
血清	51.9	> 0.98	9.7	33 - 72
血清	45.5	> 0.98	6.8	32 - 59
血清	32.6	> 0.98	7．5	18-48
平均	43.3±9.8

表3。用MSD-SEA法得到了carlumab與CCL2相互作用的平衡解離常數。

圖3:MSD-SEA。MSD-SEA在溶液平衡親和實驗中自由抗體檢測示意圖(A)。該圖描述了平衡carlumab/CCL2混合物中自由carlumab的檢測。在平衡的混合物中，使用固定在SA板上的中和生物素標記的抗id捕獲遊離的carlumab。捕獲carlumab後，用另一種抗體檢測捕獲的抗體。carlumab與PBS中的CCL2 (B)和整齊的人類血清中的CCL2 (C)相互作用的MSD-SEA平衡結合譜。堅實流暢的線條對應於一個簡單的1:1綁定模型。數據來自4倍連續稀釋的人類CCL2(最終濃度為5 nM至0.005 pM)和不變濃度的carlumab(最終濃度為10、20或30 pM)的混合物。

討論

我們開發了一種利用MSD技術(MSD- sea)的高通量方法，適用於複雜基質(如純淨血清)的溶液平衡親和性測定。該方法使我們能夠證明carlumab對CCL2的親和力很高(~40 pM)，並且不受血清成分的影響。MSD-SEA數據與SPR和KEA數據具有很好的一致性，說明血清成分不影響相互作用的檢測。

本文描述的MSD-SEA方法旨在確定在複雜基質和高通量格式中，單抗、Fab、受體、蛋白質或肽(互作物a)對可溶性配體、受體或抗原(互作物B)的平衡親和常數。綜上所述，該方法的應用包括四個主要步驟。(1)在整齊的血清中製備反應物，將恒濃度的互作物a與串聯稀釋的互作物b混合。(2)將混合物孵育至平衡。(III)孵育之後，使用電化學發光(ECL)對混合物中未結合(遊離)的mAb/Fab進行定量，使用中尺度發現(MSD)儀器進行檢測(IV)，然後將數據擬合到從別處描述的質量作用定律推導出的方程，以獲得親和常數。應用這種方法的關鍵是在步驟III中使用捕獲和檢測試劑，這些試劑針對自由形式的反應物A，不與樣品基質的任何成分(如血清)或相互作用劑b結合。抗id試劑的生成是抗體藥物開發的一個基本組成部分;因此，該方法可廣泛應用於生物技術行業。

在選擇捕獲和檢測試劑(例如carlumab抗id)時，重要的是要考慮決定這些試劑適用性的因素。其中一個因素是特異性。兩種試劑都必須與藥物特異結合，且不能與基質中的其他成分相互作用。第二個因素是捕獲試劑不能結合抗原-抗體複合物;因此，捕獲試劑必須是中和的，或受到空間阻礙，不能與絡合物結合。第三個因素是所選抗id的親和力(和動力學)在抗id用於MSD-SEA分析的適用性方麵所起的作用。用二價法測定的抗體CNTO402和CNTO6707的表觀親和度分別在pM和nM範圍內(數據未顯示)。雖然我們沒有係統地測試不同親和度的抗id的效果，但我們估計最好使用高親和度捕獲的抗id進行遊離單抗檢測，以防止在洗板和捕獲步驟中的藥物解離。

當CCL2/carlumab複合物形成並建立動態平衡時，平衡混合物中的遊離抗體即為本試驗檢測步驟中定量的遊離單抗。需要注意的是，用MSD-SEA方法測定的遊離抗體可能不能代表檢測過程中測定的“遊離藥物”在活的有機體內研究。類中綁定事件的複雜性在活的有機體內背景遠比處境大得多在體外MSD-SEA化驗。這種複雜性，再加上大量抗原-抗體複合物的形成，已被證明導致了兩者之間的差異在體外定量的不同種類(自由，限製或總數)的相互作用和在活的有機體內結果(42、43)。此外，在一個在活的有機體內在研究中，藥物的血清濃度遠遠高於我們在K下努力工作的親和力測定實驗中所用的濃度_D確定真實內在親和[7]的受控條件。Pienta和合作者[29]報告說，在carlumab臨床試驗中，達到了超過10µg/mL (>67 nM)的藥物穩態血清濃度。濃度是本征K的1000倍_D因此，carlumab對CCL2的影響高於Bee和合作者[7]描述的親和力測定的最佳點，可以得出相關的結論在活的有機體內不能代表真正親和力的親和力。然而，我們也必須考慮到重組CCL2可能不代表內源性CCL2，因為糖基化差異的潛在影響，添加親和純化標簽或對重組蛋白的其他修飾。在CCL2的情況下，內源性水平已確定在人類14-79皮摩爾水平(內部數據，未顯示)。我們沒有確定這些研究中使用的血清中內源性CCL2的實際濃度。然而，在沒有添加CCL2的血清中獲得的carlumab信號處於平衡混合物中carlumab 100%遊離的平台水平。因此，我們估計這些研究中使用的血清中內源性CCL2的水平不會影響本報告中觀察到的結果。

雖然該方法是使用MSD閱讀器作為檢測平台開發的，但它可以應用於其他檢測係統，允許HTP分析，並提供適當的靈敏度和選擇性檢測。隻要有特定的檢測試劑可用，MSD-SEA方法就可以應用於其他生物係統，例如特異性捕獲和檢測試劑，可以捕獲平衡混合物中的遊離抗體(或受體)，並在複雜混合物中對捕獲的抗體(或受體)進行特異性檢測。這種方法有附加的優點，它使用小體積(100或更少的µL/稀釋)，少量的樣品和試劑，不需要相互作用劑的放射性或熒光標記，它可以用於粗樣品，隻要其中一個反應物的濃度是已知的。如果不知道常數夥伴的濃度，可以使用樣品的不同稀釋因子進行溶液平衡滴定，直到得到一個圍繞(-1)的山坡，這是結合等溫線的理想坡度(或+1，如果數據以%界限繪製)。與其他方法相比，用MSD-SEA進行親和性測定所需的時間顯著縮短，並可應用於pM和潛在的次pM範圍內的高親和相互作用。一個潛在的限製可能是缺乏足夠的捕獲和檢測試劑。然而，對於治療性抗體來說，這不應該是一個限製因素，因為抗id試劑的生成是開發的一個重要部分。MSD-SEA可以成為生物治療候選者表征和選擇過程的一個組成部分，因為它可以用來評估候選者在血清基質中的穩定性，並用於預測候選者在生理條件下的功能穩定性。

致謝

本研究由楊森研究與發展公司讚助。我們感謝Gabriela Canziani博士和Bonnie Wu博士提供的有關抗ids親和力和中和活性的信息。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Lacy ER, Kwok D, Baker A, Seetharam S, Chaturvedi S，等。(2016)清潔人類血清中cc趨化因子配體2 (CCL2)的Carlumab親和力。生物化學分析專業2(1):http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.106

版權:©2016 Lacy ER，等人。這是一篇開放獲取的文章，根據創作共用署名許可協議(Creative Commons Attribution License)發布，該協議允許在任何媒體上不受限製地使用、分發和複製，前提是注明原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2016年7月02

接受日期:2016年9月24日

發表日期:2016年9月30日