基質輔助激光解吸電離(MALDI)質譜成像(MSI)是一種強大的技術，用於研究蛋白質、脂類和化學物質在包括植物和動物在內的生物體中的分布。MSI的主要優點是它能夠同時定位和識別父分子及其代謝物，而不需要標記和任何事先的知識。MSI被廣泛應用於檢測不同疾病的各種器官中脂質的分化模式，如阿爾茨海默病的大腦和慢性腎髒疾病的腎髒。然而，MSI在脂質檢測中的主要障礙是由於離子抑製[1]對某些類脂質的檢測靈敏度較差。特別是當所有真核生物質膜的主要成分磷脂酰膽堿(PCs)在樣品中存在時，其季銨將強烈降低所有其他脂質在正離子模式MSI測量[2]的離子產量。盡管這些離子抑製作用通常在負離子模式下不太顯著，但在負離子模式MALDI測量中，許多脂類根本無法分析，或僅顯示電離效率低[例如pc、二酰甘油和三酰甘油(DAGs/TAGs)]。

有人提出了幾種解決方案來解決這個問題。對於儀器方法，引入了“MALDI-2”技術。一個類似maldi的二次電離過程是由一個位置化激光束穿過膨脹的分析矩陣羽流[3]引發的。這是通過用脈衝紫外線(UV)激光攔截氮冷卻氣體環境中的粒子羽流來實現的。該技術將幾種膜脂類的檢測強度提高了兩個數量級，特別是膽固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、漿原(PE- o)、磷脂酰絲氨酸(PS)和中性糖鞘脂(GSLs)，如半乳糖酰神經酰胺(GalCer)，因為它們通常難以被傳統的MALDI-MSI[3]成像。這種修改的主要缺點是需要一種複雜的儀器，這在商業上是無法獲得的。

從基質的方法來看，除了傳統的基質2,5-二羥基苯甲酸(DHB)外，新的基質被開發用於在複雜混合物中“揭示”某些脂類，如GSLs[4-7]，其中大多數檢測到的物種是鈉和鉀加合物。還開發了幾種新的基質溶液，以最大限度地檢測[M-H] -神經節苷類物質，如2,6-二羥基苯乙酮[DHA]/硫酸銨3 mM用於提取神經節苷，DHA/硫酸銨125 mM/七氟丁酸[HFBA] 0.05%用於溶解在50%乙醇[8]中的成像應用。

隨著納米材料的快速發展，納米粒子的質譜分析應用越來越廣泛。這種方法比傳統的質譜法有幾個優點

有機基質在許多方麵，包括高吸收係數，優良的穩定性和生物相容性，易於製備和化學修飾[9]。此外，由於矩陣的化學噪聲最小，質譜也得到了簡化。由於納米顆粒基質層穩定、可重複且均勻，可以獲得幾種脂類的高質量區域分布圖像。

最初，含氧化鐵的納米顆粒被用於檢測PC和GalCerin正離子模式和硫化物負離子模式下的分布[12,13]。然而，納米粒子對硫化物的檢測卻出乎意料地弱於DHB。因此，幾個小組試圖開發一種新的納米粒子基質係統用於MSI分析，以獲得更高的空間分辨率和靈敏度。核心金屬主要為金、銀及其混合物[14-16]。納米銀顆粒(AgNPs)和納米金顆粒(AuNPs)已被證明在檢測[M+Au]中性脂類(如tag、膽固醇)時很有用。⁺或[M + Ag)⁺加合[11,17,18]和神經節苷分布[19]。

用烷基胺修飾的金納米顆粒(AuNPs)已被用於可視化GSLs在生物組織切片中的分布。已知aunp能以高靈敏度電離GSLs[15,20]。AuNPs的應用使磷脂酰肌醇(PI)、硫化物和神經節苷類(GM1、GM2、GM3、GD1和GD3)在負離子模式[18]下具有高靈敏度的檢測。應用aunp分析小鼠大腦，實現了GSLs[18]小成分的預期可視化。另一方麵，AgNPs在正離子模式[11]下分析中性脂類如膽固醇、神經酰胺、dag和tag時也被證明是有效的。不幸的是，與經典的MALDI基質相比，這些納米顆粒基質在激光誘導解吸過程中還會產生更高的熱負荷，這種高負荷會導致更複雜的脂類(如TAGs)[21]的破碎。此外，這些額外的步驟也會導致生物分子的損失，尤其是低豐度的脂質。

生物化學方法也被測試減少離子抑製通過酶降解PCs。磷脂酶C (PLC)已被用來切割磷酸部分旁邊的PLs，並在不損害疏水膜錨(二酰基- pl前體的DAG分子)的情況下消除帶電荷的頭基。Sparvero等人[22]將組織上PLC消化與額外的化學物質應用於含羧基/氨基分子的交聯，並證明了MALDI-MSI在負離子模式下以50-200 μ m的橫向分辨率檢測線粒體心磷脂和腦神經節苷的改進[22,23]。然而，純PLC處理後的脂質正離子模式MALDI-MSI分析在這兩項研究中均未報道。

Vens-Cappell等人[24]最近演示了一種純PLC處理脂質正離子模式MALDI-MSI分析。他們對16 μ m厚鮮凍小鼠腦和腎器官切片進行了組織上PLC消化，以獲得GSLs的高對比度MALDI-(質譜)MS圖像。PLC被簡單地稀釋在水中，並調整到50 U/mL的酶活性。40 μ L的PLC溶液在37°C下斑點於切片上30 min。除去散裝液體，風幹，停止反應。在用升華/再結晶協議包覆DHB基體後，產生約2 ~ 3 μ m[3]的平均晶體尺寸。MALDI-MS成像使用改良的Synapt G2-S質譜儀(Waters, Manchester, UK)，使用直徑約為5 μ m的有效聚焦光斑[3]。每個像素用30個激光脈衝照射。

通過與兩個相鄰的冠狀腦組織進行比較，其中一個經plc處理，MS圖像和相應的質譜顯示GalCer的離子豐度(d18:1/ C24:1)和其他9種檢測到的galcerlipoform的離子豐度提高了約10[24]。在MS測量後，用plc處理切片進行免疫組化染色進一步證實了GalCer的總體分布。此外，PLC治療還顯示膽固醇信號增加，強度約為5倍。這是因為磷脂(PL)降解將揭示離子種類顯示質量接近於那些豐富的pc的等壓。例如，[GalCer (d18:1/C24:1)+Na]⁺m/z 832.66處的離子信號常被更強的[PC (38:4)+Na]信號所掩蓋。⁺表現出約80 mDa的低質量。

其中一個挑戰是，在用酶水溶液培養切片後，GalCer、膽固醇或殘留分子PLs是否發生明顯擴散。幸運的是，沒有觀察到這種擴散，這表明細胞膜的整體結構完整性被廣泛保存。

由於在plc處理過程中產生了DAG片段和分裂的親水頭基團，作者也檢查了這些片段是否被檢測到並幹擾了最終圖像。結果表明，這些片段可在[24]信號強度較低的組織中檢測到。相反，在反應溶液和整個組織切片中都發現了分裂的親水頭基團。

通常，PLC解決方案通常使用HEPES緩衝液來獲得最佳pH值約為pH值7。我們還知道，這些緩衝液強烈幹擾分析物/基質結晶，從而降低離子產量。因此，這種緩衝PLC解決方案將大大降低MALDI-MS分析的靈敏度。為了避免這種情況，本研究中的PLC隻是在水中稀釋，而不是緩衝[24]。一項使用小鼠大腦切片的時間過程研究表明，在37°C下培養30分鍾的PLC足以提供pc的完全降解和隨之產生的GSL離子信號的最大化，這表明組織切片似乎保留了足夠的內源性鹽含量，以確保在水溶液和緩衝溶液[24]中具有相同的PLC活性。然而，長時間的孵育，例如16小時的夜間孵育，導致了其他濃度較低的PLs離子的信號減弱。這可能是由於在長時間的孵育中PLC的降解。

另一個有用的發現是GSLs的信號增強，即使組織切片已經通過標準MALDI-MSI“預先分析”(例如，首先記錄PC輪廓)。作者隻需要用水和0.1 M醋酸鈉衝洗除去載玻片上的基質塗層，然後塗上PLC和第二層DHB基質塗層[24]。然後他們對同一張幻燈片進行了第二次掃描。結果表明，GSLs的信號仍有增強現象。這些結果表明，盡管觀察到橫向分辨率輕微降低到約20-30 μ m，但這種順序方法是可行的。這種現象可能是由於通過基質升華、再結晶和基質洗滌步驟從組織中反複提取分析物造成的。

總之，這種組織上的PLC消化已被證明通過減少離子抑製效應成功增強中性GSLs的MALDI-MSI。該方法無需對MALDI-MS或矩陣進行複雜的修改，實現簡單，優於現有方法。該方法將有助於未來對人類疾病中GSLs的分析。

利益衝突聲明

作者聲明沒有競爭利益。

確認

國家自然科學基金項目(81170681和21477101);香港研究資助局(研資局grf463612及14104314);香港浸會大學教師研究補助金(FRG1/13-14/070, FRG2/15-16/067);香港衛生及醫學研究基金(HMRF/ 03144376);及香港學術諮詢處2015-16年度研究補助金。

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引用:鍾ac(2016)綜述:鞘脂的Maldi-MS增強成像。生物化學分析研究2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.105

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收到日期:07年6月2016年

接受日期:2016年8月27日

發表日期:2016年9月01日