摘要

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基溴化四唑)法能夠區分活細胞;產生的信號取決於細胞的激活程度。在這篇論文中，我們展示了如何在有限數量的細胞(1x10)上進行四唑染色^3.)在基本條件下增強。此外，基本條件產生一個更穩定的染料，隻有一個峰突出在545nm，消除背景。以NaOH - 7N溶液為增強劑。基本環境使從少量細胞產生的福瑪讚染料由棕色變為濃紫色，提供了一種穩定、靈敏的檢測方法，從而提高了檢測的有效性。這一策略可作為分光光度計分析中福馬讚染料的檢測極限是一個問題和平板閱讀器不可用的有用工具。

關鍵字

四唑染色;肝癌;氫氧化鈉

簡介

由Mosmann最初描述的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)2,5-二苯基溴化四唑)測定法已被用於開發哺乳動物細胞生存和增殖的定量比色測定法，並不斷改進該方法以獲得更好的分辨率[1-3]。對於存活和增殖的測定，其他方法，如[^3.H]胸苷吸收(^3.H-TdR)或台盼藍可用，但實際上，MTT法取代了兩者。產生的信號取決於活細胞的線粒體脫氫酶的能力，當細胞色素c未被釋放時，從四唑鹽生產福馬讚[4,5]。然而，原來的技術有幾個技術限製，即低於最佳靈敏度，添加有機溶劑溶解藍色福馬甲產品時由於蛋白質沉澱而產生的背景變化，以及產品的溶解度低。這些問題已通過若幹改進克服:i)在培養培養基中避免血清和酚紅;ii)使用更高濃度的MTT, iii)在反應後消除含有MTT的介質，隨後使用純丙醇、異丙醇或乙醇快速溶解福馬甲晶體，iv)在雙波長分光光度計[3]中使用更明智的參考波長。由於這些改進，測試的可靠性和靈敏度已提高到可以取代[^3.H]胸苷苷攝取試驗，在許多情況下，在生長因子或細胞毒性試驗中測定細胞增殖或存活。結果可以在微板閱讀器或標準分光光度計上讀取。值得注意的是，MTT法非常簡單，主要優點是:i)消除放射性化合物;(二)再現性;Iii)性能和量化便利和iv)快速。然而，由於讀取峰值之間的可變性，還有進一步的技術限製[5-8]。在此，我們對四唑染料技術進行了進一步的改進，使用堿性條件(NaOH 7n)，提高了染料的穩定性和靈敏度。為了驗證穩定性(在福瑪讚細胞還原後)，在400 - 700 nm的波長範圍內監測吸光度。簡單地說，MTT溶解在原液中:5 mg/ml MTT (Sigma)在RPMI- 1640、DMEM或DMEM/F-12中，不含酚紅和血清(Gibco, Invitrogen)。溶液經0.2 μ m過濾器過濾，4℃保存。 For the assay 1:40 dilution of the 5 mg/ml stock was used in a volume of 1.0 ml for each well of 24-wells plate. 1 × 10^3.細胞在37°C孵育120分鍾。第一步，將轉化後的染料用1ml酸性異丙醇/0.04 N HCl溶解，上下移液多次，以確保轉化後的染料完全溶解，然後轉移到1.5 ml eppendorf管中，以13000轉/分離心2分鍾。將上清轉移到新的epppendorf管中，在染料溶液中加入25µl的氫氧化鈉(NaOH) 7 N，旋轉10秒，13000 rpm離心2分鍾。與之相反，我們發現的蛋白質濃度測定方法WST- 8福馬讚(Dojindo)是MTT在基礎條件下被還原為福馬讚，我們的方法是基於已經還原的福馬讚在基礎條件下能夠產生更高強度的顏色，在監測吸光度[9]時更加穩定。我們觀察到福馬甲染料在酸性pH下呈棕色，在pH為9.5時變為深紫色，在545 nm處有最大波長峰;該溶液在室溫下可穩定使用一周以上。從圖1A-B中我們可以看到，在所使用的條件下，在545 nm處隻有一個峰被突出顯示。此外，為了評估改性染料的靈敏度，以mtt -福瑪讚(Sigma)作為參考標準，與福瑪讚增強劑一起檢測初始量的1/10，並具有相當的吸光度值。在沒有NaOH 7N的情況下，mtt -福馬甲聚糖(圖1C) 50 μ g或(圖1D) 500 μ g在400-700 nm波長範圍內未檢測到峰。用Ultraspec 2100 pro分光光度計(Amersham Biosciences)在塑料試管中檢測轉化染料的吸光度。 According to the capability of the formazan to turn to intense purple after exposition to a strong base milieu, the now abolished variability among read peaks makes the MTT assay more attractive even if laboratories cannot use plate reader supply.

致謝

這項工作得到了Ministero dell 'Istruzione, dell 'Università e della Ricerca (MIUR, Italia)的資助。作者感謝D. Sturino博士的英文修訂。

圖1:福馬讚的基本條件提高了MTT測定染料的靈敏度。在MTT-formazan (A) 50 μ g或(B) 500 μ g的存在下加入增強劑NaOH 7N，在545 nm波長處有清晰的峰。在不含NaOH 7N的情況下，MTTformazan (C) 50µg或(D) 500µg在400 ~ 700 nm波長範圍內均未檢測到峰。

參考文獻

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條信息

文章類型:簡短的溝通

引用:Perri M, Caroleo MC, Cione E(2016)福馬讚提高MTT比色法染料靈敏度的基本條件。生物化學分析研究1(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.104

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出版的曆史:

收到日期:2016年3月30

接受日期:2016年5月10日

發表日期:2016年5月16日