熒光顯微鏡已廣泛應用於生物樣品的傳感和成像，包括細胞成像、生物分子實時監測和生物標記物檢測。常用的光學顯微鏡技術有共聚焦、外熒光、多光子、全內反射熒光顯微鏡(TIRFM)。在所有的熒光成像技術中，TIRFM，又稱倏逝場顯微鏡，因其獨特的特性而受到了相當多的關注。TIRFM被認為是一種強大的技術，它使已而且體外在單分子和單細胞水平上監測生物分子的動力學和動力學相互作用。

TIRFM的配置和屬性

當激發光束通過致密介質(高折射率)時，遇到另一個密度較小(低折射率)且入射角大於臨界角(θ)的介質時，發生全內反射_c)．臨界角由斯涅爾定律導出:θ_c= sin-1 (n₂/ n₁),其中n₂和n₁分別是密度大和密度小的介質的折射率。一定量的入射光在界麵處被反射掉，而不是通過密度較低的介質傳播，這種現象被稱為全內反射。與此同時，部分入射能量將通過接口傳輸，並產生一個稱為倏逝場的靜止電磁場。與其他形式的光不同，倏逝光的強度在亞波長距離上呈指數衰減。消散場的強度(I_z)在任意位置(z)上可以用Iz =I計算₀經驗值^{- z / d},在那裏我₀當z=0時，d為倏逝場的穿透深度，可由d=λ / (4π (n ?₁²sin-1θ- n₂²）^1／2)，其中λ為激發光束在真空中的波長。光束的穿透深度一般為~100- 300nm。在棱鏡型TIRFM中，穿透深度可由三個因素控製:(i)激發源波長，光源波長越長，倏逝場越深。(ii)光源入射角增大，穿透深度減小而入射角增大。最後，(iii)低密度介質的折射率，隨著低密度介質折射率的增加，穿透深度也會增加。

在TIRFM中，由於倏逝場的強度呈指數衰減，靠近界麵的熒光團比遠離界麵的熒光團受到更強的激發，從而得到界麵附近熒光團的高對比度圖像。此外，由於消失場的穿透深度很淺，隻有場內的熒光團會被激發，而體溶液中的其餘熒光團將保持“沉默”。它具有較高的信噪比，減少了對分析物的光損傷。

圖1:TIRFM設置示意圖。

單個生物分子和細胞的實時監測

報告已經證明了TIRFM的能力體外例如，疾病相關生物標誌物的定量，用於定量細胞裂解物和人血清樣本中的microRNAs (miRNAs)和循環miRNAs的單分子檢測方法。所開發的檢測方法具有高度的敏感性、特異性，可依次區分不同的癌症分期[1,2]。研究人員還應用TIRFM成像係統監測β -澱粉樣肽的聚集動力學[3-10]。Simon小組報告了TIRFM作為一種成像方法的效用，揭示了以前未觀察到的單個病毒粒子起源的觀點。他們還能夠探索病毒裝配的不同參數，這是其他傳統技術無法達到的。Nosrati等人的[12]監測了精子運動，眾所周知，精子運動在受精過程中起著至關重要的作用，並能夠解決這種運動的本質。利用TIRFM，他們選擇性地對運動的人類精子和公牛精子成像，揭示了二維(2D)的“滑行”遊泳模式。這種行為被發現與大塊和近壁遊泳模式不同。研究了培養基粘度的影響，並提出了一種適合於高粘度和狹窄的輸卵管內管腔的人類精子的策略。在廣域模式下對單分子或單細胞的實時監測和跟蹤對於高通量的研究非常有吸引力。 Coupling several lasers of different excitation wavelengths which can be switched in microseconds precisely with an acousto-optical tunable filter (AOTF) allows sophisticated multicolor biomolecular imaging and tracking [13]..1

TIRFM不再局限於2D成像;Fang group研究表明，通過收集不同入射角的熒光強度，可以提取細胞基底側膜附近熒光納米粒子的z位置。一旦入射角降低到亞臨界範圍內，TIRFM作為一個偽TIRFM工作，通過它可以從下到上監視整個胞體[14]。由此建立了三維跟蹤策略[13]。

簡而言之，高靈敏度的單分子和單細胞熒光顯微鏡技術，如TIRFM，是解決臨床和科學挑戰的強大工具。然而，新穎的高空間分辨率顯微鏡技術是評估那些感興趣的生物分子在複雜細胞環境中的功能的有價值的工具。

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引用:何樂生，李文華，王淑娟(2016)觀察分子與全內反射熒光顯微鏡的相互作用。生物化學分析研究1(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.102

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出版的曆史:

收到日期:2015年12月21日

接受日期:2016年2月16日

發表日期:2016年2月20日