摘要

盡管腎髒移植接受者的短期結果有所改善，但長期結果仍然不理想。免疫排斥反應是移植物失敗的主要原因，最近的研究指出，未被發現的“沉默的”亞臨床急性排斥反應是這一問題的關鍵組成部分。雖然活檢仍然是檢測無聲排斥反應的金標準方法，但非侵入性方法具有顯著優勢，特別是在患者安全和對穩定患者的連續監測方麵。本文詳細介紹了TruGraf最終成功開發和商業化過程中所麵臨的現實挑戰，TruGraf是一種經臨床驗證的、基於血液的基因表達檢測方法，它提供了在腎功能穩定的腎移植受者中減少使用監測(協議)活檢的潛力。

關鍵字

非侵入性移植生物標誌物;TruGraf;腎移植;活組織檢查;腎功能

簡介

腎移植是大多數慢性腎衰竭患者[1]的最佳治療方法。然而，腎髒移植的長期成功與最佳[2]相差甚遠。2017年，死亡供腎受體的10年全因移植失敗發生率為49.7%，活體供腎移植為34.1%[3]。免疫排斥反應是移植物失敗的一個主要原因，是由T細胞(T細胞介導的排斥反應，簡稱TCMR)或抗體(抗體介導的排斥反應，簡稱ABMR)對移植物的攻擊所驅動的，在某些情況下，這兩種機製的結合(混合排斥反應)也會引起免疫排斥反應。長期移植物丟失的一個關鍵早期因素是亞臨床免疫損傷，導致同種異體腎移植物的慢性損傷[4-8]。直到最近，還沒有商業化的完全有效的非侵入性檢測來監測腎功能穩定的患者的無反應排斥[9]。因此，相當多的中心依靠監測(協議)活組織檢查來檢測早期沉默性排斥反應，而其他中心則選擇不進行這些檢查，等待移植物損傷和損傷的臨床證據[10,11]。

情景分析

檢測繼發於排斥反應或其他原因的腎損傷的標準非侵入性監測包括測量血清肌酐水平和免疫抑製藥物水平，這兩者都是不敏感和非特異性的。嚴重排斥反應的臨床表現，如發熱，移植物疼痛，或尿量減少，可能存在，但在目前的免疫抑製方案中不常見。因此，目前的無創監測僅在排異反應發生晚期，且僅在移植物發生了顯著的、潛在的、不可逆的損傷後才發現。活檢通常用於確定急性腎功能不全的原因。

活檢是昂貴的，侵入性的，並受到[12]解釋的顯著差異。此外，活檢除了疼痛和不方便外，還會使患者麵臨嚴重並發症的風險，如感染、出血，甚至移植物丟失。然而，指征活檢在腎功能不全患者的管理中仍然是必不可少的，並在移植項目中廣泛使用。與此形成鮮明對比的是，盡管許多移植項目已經采用常規的監測活組織檢查來檢測腎功能穩定患者的亞臨床急性排斥反應(subAR)，但一些因素阻礙了其他項目效仿。這些包括但不限於上述所有問題，此外，病情穩定的患者在絕大多數情況下接受不加選擇地活檢，導致陰性(不必要的)侵入性手術。因此，一種非侵入性監測策略取代侵入性活檢是非常必要的，並且在過去幾年一直是一些研究人員的重點。

以前的研究人員專注於開發尿液和血液中的非侵入性生物標誌物來診斷移植物功能障礙(臨床急性排斥反應- car)患者的排斥反應，試圖取代指征活檢。這種方法有兩個主要的謬誤:第一，雖然一些亞ar患者發展成cAR，但另一些患者表現出持續的亞ar，導致更多的慢性移植物損傷;其次，由於缺乏對每個樣本的配對活檢，很難確定從這些樣本中產生積極結果的生物信息學方法是真實的。出於這個原因，我們開始開發亞ar特異性的生物標誌物，隻使用腎功能穩定的患者的血液樣本和協議活檢。

subAR外周血生物標誌物的開發

確定了對穩定患者進行活檢的非侵入性替代的必要性，我們開始發現並驗證一種外周血生物標誌物，以檢測這些患者中的亞ar，作為一種“規則”測試，類似於活檢。雖然我們的臨床試驗和樣本收集方案設計得很好，但由此產生的證據數據和生物標誌物性能導致我們重新思考生物標誌物的使用背景(COU)。

亞臨床急性排斥反應(subAR)，也稱為“沉默”排斥反應，是一種組織學上定義的急性排斥反應，其特征為腎小管間質單個核細胞浸潤，從腎功能正常或穩定的患者的活檢標本中發現[4-8]。在nih讚助的CTOT-08研究中，307名腎移植受者[7]，基於監測活組織檢查，3-6個月時subAR的自然患病率為20%，12和24個月監測活組織檢查為25%，[7]的總患病率為35%。值得注意的是，根據Banff標準[14]進行中心病理學分類時，80%的subAR屬於邊緣類型，重要的是，75%的病例活檢正常。在兩年的時間點上，接受活體組織檢查的subAR患者比未接受活檢的患者預後更差。這是基於綜合臨床終點(CCE)，包括活檢證實的任何“原因活檢”的急性排斥反應(BPAR)，或24個月活檢(中央讀數)顯示慢性損傷證據的間質纖維化和管狀萎縮(IFTA) Banff級≥II IFTA (ci≥2或ct≥2)，或估計腎小球濾過率(GFR)下降>10mL/ min/1.73m²移植後4 - 24個月[7]。SubAR還與I類和II類新生供體特異性抗體(dnDSA)形成的較高頻率相關[7,15]。

除了上述CTOT-08數據外，近期的一些臨床研究也將subAR與不良預後聯係起來[4- 8,15-19]。一項針對接受類固醇快速停用治療的患者的研究比較了無炎症患者和亞臨床炎症患者在3個月的監測活檢中的結果。亞臨床炎症患者24個月時血清肌酐水平顯著升高，[16]12個月時活檢異體移植物慢性指數、後續BPAR發生率和dnDSA發生率均顯著升高。澳大利亞的一項大型研究比較了正常活檢患者、排斥邊緣患者和T細胞介導的急性排斥患者的結果。與正常活檢的患者相比，發生邊緣性排斥反應的患者腎功能較差，IFTA增多，隨後發生急性排斥反應，異體移植物衰竭，患者死亡[7]。最近一項針對103名兒童腎移植受者的研究，檢查了兒童腎移植後亞臨床炎症表型和長期預後，強調了亞ar[18]的重要性和治療。在這項研究中，監測活檢在前6個月進行，並在5年測量急性排斥和移植失敗的複合終點(CEP)。接受治療的邊緣性排斥反應達到CEP的比例為41%，未接受治療的為67% (p<0.001)。此外，最近的另一項研究表明，早期急性排斥反應與晚期急性排斥反應的發生和移植物損失[19]有關。

a)開發和b)商業化subAR的非侵入性生物標誌物的試驗和磨難

發展:TruGraf®血液基因表達檢測(移植基因組公司，Mansfield, MA)是一種基於微陣列的檢測，分析外周血中的基因表達譜(GEP)。我們最初的策略是製定一種“規則”檢測，即陽性檢測將高度預測陽性活檢(subAR)。在生物信息學方法[20]中，我們使用了基於自舉的鎖定支持向量機(SVM)分類器，以防止發現集過擬合用於內部驗證。我們發現了兩個有趣的觀察結果:首先，在不同的閾值處，我們用PPV交換NPV，直到使用這種方法不可能有“規則”測試。然後我們切換到隨機森林(RF)作為生物信息學方法[21]，並使用了不同的閾值，但很明顯，生物標誌物的預期用途需要改變。因為使用RF的性能指標更好，我們繼續使用RF，但選擇了更有利於“排除”測試[21]的閾值。該產品是一種GEP分類器，可與腎功能穩定的患者的正常腎活檢(移植excellent - tx)或無正常腎活檢(not-TX)相關聯。TruGraf試驗的所有方麵的發現和外部驗證都是在與流行隊列的活組織檢查配對的血液樣本上進行的。為了驗證，從預先選擇的生物信息學導出的模型和用於測試發現隊列的性能的閾值被鎖定。這些數據使我們在[22]患者的早期訪問計劃(EAP)中使用這種方法進行外部驗證。 The external clinical validation from seven EAP transplant centers defined the key clinical performance parameters for this assay, as summarized in table 1 and figure 1. In this study, the high negative predictive value (NPV) of TruGraf was demonstrated in clinical use, making it a strong rule-out test. Over 90% of stable patients who received a TX results were confirmed to have an immune quiescent phenotype, meaning that a physician can have a high degree of confidence that a patient who tests as TX does not harbour silent subclinical rejection. Importantly this study also found that up to 65% of surveillance biopsies could be avoided in the cohort tested. Unpublished data involving analysis of an additional 129 biopsy-confirmed blood samples provided by Northwestern University (originally used for the CTOT-08 study) revealed identical performance metrics for TruGraf (NPV of 90%). A fourth publication described the impact of TruGraf results on physician decision making for clinical decisions [23]. This study highlighted the high degree of confidence physicians place in the ability of TruGraf to provide valuable, added information that could lead to avoidance of unnecessary surveillance biopsies as summarized in table 2. In the prospective study (n=45) 87.0% of physician responses indicated that the result of the TruGraf test supported their management decision in a patient with stable renal function, with a corresponding rate in the retrospective study (n=192) of 87.5% [23].

圖1:TruGraf結果的單個位點準確性(n=192)顯示TruGraf TX結果與七個研究位點患者臨床表型之間的一致性[22]。

						調整為24.5%亞ar患病率		% TX(活檢幸免)
	N	靈敏度	特異性	PPV	淨現值	PPV	淨現值
所有的樣品	192	76.5%	73.4%	38％	93.5%	48%	91％	65％
配對的血液和活檢子集	99	70.8%	74.7%	47%	89％	48%	89％	64%

表1:多中心觀察性研究中TruGraf v1的性能特征總結[22]。
淨現值=負麵預測值;
PPV =陽性預測值。

問卷調查的時機	臨床實用程序的反饋	是的	沒有
準(n = 45)	TruGraf結果是否支持您關於如何處理血清肌酐穩定的患者的決定?	39 (87%)	6 (13%)
	TruGraf的結果是否鼓勵你們在未來的患者管理中使用TruGraf係列試驗?	42 (93%)	3 (7%)
回顧(n = 192)	這個結果是否會影響您對患者的管理，包括維持或改變免疫抑製、改變就診頻率或決定是否進行活檢?	168例(87.5%)	24 (12.5%)

表2:主要調查者對前瞻性和回顧性問卷的回答[22]。

由於這些經驗，我們改變了建議的COU，從取代監測活檢來檢測次ar，到減少穩定患者的必要活檢數量，這應該會導致許多侵入性更小的程序(表1)，以及顯著減少陰性或不必要的活檢。COU在CMS最近的批準中提出:“TruGraf檢測用於腎功能穩定的腎移植受者，在使用監測活檢的機構中作為監測活檢的替代方法。”雖然主要用於排除subAR，但預計兩個進行或不進行監測活檢的中心都可以使用該測試來評估穩定患者[24]是否需要監測活檢。

圖2顯示了TruGraf應用於腎移植受者臨床護理的建議方法。對於腎功能穩定的患者，TruGraf結果“TX”識別出那些具有較高的免疫停滯可能性和較低的組織學定義的排斥反應(在邊界水平或更高水平)的患者。“Not-TX”的結果確定了那些沉默排斥不能完全排除的人，因此具有更高的免疫激活風險和邊緣或更高的排斥反應。結果為“Not-TX”的患者可能從進一步的評估和可能的治療改變中受益。早期發現這些患者可能會更好地分配醫生資源，並可能在捐獻腎髒發生永久性損傷之前逆轉這一過程。

圖2:建議腎移植受者在移植後5年內使用TruGraf。檢測頻率和結果的臨床應用基於專家意見。TX=移植效果良好，表明移植腎的免疫穩定;NotTx =異常結果。

TruGraf商業化途徑:分子診斷服務(MolDX)項目開發於2011年，由Palmetto GBA運營，這是一家醫療保險和醫療補助服務中心(CMS)醫療保險行政承包商。它有以下功能:

• 通過注冊分子診斷測試，促進詳細和唯一的識別，以便利索賠處理和跟蹤使用情況。
• 建立臨床效用預期。完成已發表測試數據的技術評估，以確定臨床效用和覆蓋率。

2019年11月25日，CMS批準了TruGraf商業檢測的報銷。

最近發表的一項研究評估了在一個不使用監測活檢[25]的穩定腎移植受者中進行連續TruGraf檢測的臨床有效性。28例患者在多個時間點的血清肌酐水平和TruGraf檢測與臨床隨訪相關。與試驗的獨立臨床評估相比，所有試驗TruGraf結果的一致性為77% (54/70);試驗1為79%(22/28)，試驗2為75%(21/28)，試驗3為79%(11/14)。本研究的NPV為98.0%，臨床應用分析表明，77%的TruGraf結果將有助於患者管理。這些結果表明，在那些不將監測活檢作為其護理標準的一部分的移植中心，連續TruGraf檢測具有價值。在無需活檢的TruGraf檢測結果為TX的患者中，高NPV證實免疫靜止的概率很高。

結論

無聲的亞臨床排斥反應是腎髒移植受者長期預後較差的一個重要因素。到目前為止，subAR隻能通過侵入性和有風險的協議監測活檢來排除或排除，導致大量不必要的活檢，因此對患者的安全造成不必要的風險。因此，顯然需要進行非侵入性檢測來識別腎功能穩定的移植腎中存在亞ar的患者。為了響應這一需求聲明，我們首先著手開發一種“規則”測試，以取代常規使用協議活檢作為使用上下文。然而，基於我們的生物標誌物的證據性能數據，我們確定它最好用作“排除”檢測，然後修改擬議的COU，以減少目前使用這些生物標誌物的項目中的協議活檢的很大比例;在那些沒有的情況下，讓更少的患者承擔活檢的風險，同時減少不必要(陰性)活檢的數量可能提供一個有吸引力的監測策略[24]。為此，TruGraf是第一個也是唯一一個設計和驗證用於排除腎功能穩定的腎移植受者無聲亞臨床排斥反應的非侵入性檢測。

非侵入性血液檢測可以比監測腎活檢進行得更頻繁，對患者來說侵入性更小，痛苦更小，風險更小，並可能為衛生服務係統節省大量成本。

的利益衝突

MRF, SBK和SR是eurofin - transplantation Genomics的全職員工，他們開發了本文中描述的TruGraf檢測。JJF和MMA是eurofin - transplantation Genomics的顧問。

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文章類型:評論文章

引用:首先MR, Kleiboeker SB, Rose S, Friedewald JJ, Abecassis MM (2020) TruGraf，一種驗證過的無創移植生物標誌物的開發和商業化的現實經驗。生物化學分析4(2):dx.doi.org/10.16966/2576-5833.123

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出版的曆史:

收到日期:2020年4月24日,

接受日期:2020年5月11日

發表日期:2020年5月18日