摘要

目的:膠質母細胞瘤(GBM)是腦瘤中最常見的一種，預後普遍較差。在容易獲得的血清樣本中開發預後生物標誌物有可能通過個性化治療計劃改善GBM患者的預後。

材料/方法:在本研究中，30例新診斷為GBM的患者的治療前血清樣本使用40蛋白複合ELISA平台進行評估。使用惡性膠質瘤生物發現門戶(GBM-BioDP)，使用癌症基因組圖譜數據庫對潛在相關基因靶點進行分析。通過對40個複雜基因進行功能分組分析，篩選出臨床相關分子的10個生物標誌物亞組，根據方差程度、與其他生物標誌物缺乏共線性和臨床興趣，從每組中選擇2個基因。采用多變量Cox比例風險法分析總生存率(OS)、基因表達和切除狀態作為協變量之間的關係。

結果:40個MSD分子中的30個被定位到TCGA中的已知基因，並將患者隊列分為兩個主要的集群，主要圍繞Verhaak分類的經典和前神經和間質亞型。使用預後指數(PI)中的30個蛋白質的值表明，即使按年齡和MGMT狀態分層，整個隊列中PI低於中位數的患者比PI高於中位數的患者活得更長(HR 1.8, p=0.001)。這個發現在每個Verhaak子類中也是一致的，非常顯著(範圍p=0.0001-0.011)。

此外，在TCGA數據庫中發現，包括CRP、SAA、VCAM1、VEGF、MDC、TNFA、IL7、IL8、IL10、IL16在內的10種蛋白質的亞組具有預後價值，並與接受腫瘤切除術後常規放療和替莫唑胺治療並同時添加丙丙酸的GBM患者的總生存率呈正相關。

結論:這些發現表明，用蛋白質組學方法開發GBM治療的預後分析可能具有潛在的臨床價值。

簡介

膠質母細胞瘤(GBM)是美國成年人中最常見的原發性腦瘤。目前的治療標準包括手術切除，同時進行放療(RT)和替莫唑胺(TMZ)治療，然後輔助TMZ給藥，中位生存期為14.6個月。然而，即使預後極差，仍有一小部分患者[2]存活5年(10-15%)。因此，嚐試開發具有預後價值的篩查工具，以確定那些預後較好的患者。GBM腫瘤的分子分型，如癌症基因組圖譜(TCGA)已經確定了GBM的四種主要亞型;Pro-Neural, Neural, Classical和Mesenchymal雖然這四個亞組的生存差異是相似的[3]。基因組/表觀遺傳分析已確定o6 -烷基鳥嘌呤DNA烷基轉移酶(MGMT)啟動子甲基化狀態是一種預後和預測因子，有助於製定GBM治療方案[4]。MGMT狀態可能是膠質母細胞瘤患者醫療管理中最被接受的生物標誌物，其他一些分子標誌物包括表皮生長因子受體(EGFR)和異檸檬酸脫氫酶(IDH)的突變可能具有預後價值[5]。此外，血小板衍生生長因子受體A (PDGFRA)、腫瘤蛋白p53 (TP53)和循環腫瘤細胞(CTC)也被確定為GBM腫瘤[6]患者的基因表達和患者預後相關的生物標誌物。然而，這些潛在生物標誌物的檢測缺乏標準化，限製了它們的用途。

雖然這些生物標記物可能很有前景，但它們需要通過手術切除的原發腫瘤組織進行分析。由於手術切除是大多數GBM患者的標準治療方法，因此應該能夠獲得組織標本，但標本數量的限製以及組織采集和處理的標準化仍然是重大障礙。此外，手術切除本身仍然是影響總生存期的一個重要臨床變量，因為切除範圍與總生存期和無進展生存期之間均顯示出正相關關係，支持全切除[7]優於次全切除或活檢。由於腫瘤組織有時無法獲得或數量有限，因此有必要從非腫瘤組織中開發生物標誌物。

雖然目前還沒有經過驗證的GBM循環生物標誌物被應用到臨床實踐中，但由於可獲得性、連續采樣能力和較低的成本，使用循環生物標誌物治療GBM仍然是一種有吸引力的方法。已在血液、尿液和腦脊液中鑒定出GBM的新興循環生物標誌物。這些包括循環腫瘤細胞、無細胞循環腫瘤DNA、miRNA和含有腫瘤衍生核酸[8]的細胞外囊泡的鑒定。GBM的蛋白質組學生物標誌物研究也證明了蛋白質特征對患者的預後具有初步價值。質譜對GBM患者血漿蛋白質組學特征的比較顯示，血漿中富含亮氨酸α -2糖蛋白1 (LRG1)、c反應蛋白(CRP)和補體成分9 (C9)的濃度與腫瘤大小[9]和細胞表麵膜蛋白特征CD44、血管細胞粘附分子1 (VCAM1)、血紅素加氧酶(脫環)1 (HMOX1)和轉化生長因子相關。血漿中分泌的β -誘導(big3)能夠將GBM患者與健康對照組[10]區分開來。此外，使用非腫瘤特異性蛋白作為GBM的生物標誌物包括基質相關蛋白，如YKL-40，基質金屬蛋白酶，如基質金屬蛋白酶-2 (MMP2)和基質金屬肽酶(MMP9)，急性期蛋白，如觸珠蛋白，與中樞神經係統相關的細胞係特異性蛋白，如膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和S100鈣結合蛋白B (S100B)以及許多其他細胞因子和生長因子，包括血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(FGF2)和轉化生長因子β 1 (TGFB1)[8,11]。在本研究中，我們對GBM患者最終放化療前收集的樣本進行了多重細胞因子測定，並將其與總生存期和無進展生存期進行比較。

方法和材料

協議信息

正如之前報道的，一項開放標簽的II期研究(NCI06-C-0112)在國家癌症研究所和弗吉尼亞聯邦大學進行，研究對象為組織學證實的GBM患者，年齡18歲及以上，預期壽命大於8周，在登記[12]前不超過6周進行手術。該方案經過NCI機構審查委員會的審查和批準，所有患者都簽署了書麵知情同意書。本研究中使用的樣本是在治療開始前從每個患者收集的。患者每日給予丙戊酸/放療/替莫唑胺治療6周。根據實體瘤療效評價標準(RECIST)和RANO標準回顧性分析治療效果[13,14]。進展的時間從治療方案開始到症狀進展或影像學進展。總生存期(OS)測定從治療方案開始到死亡之日。

多路生物標誌物檢測

使用市售的中尺度診斷V-plex ELISA法篩選患者血清中的蛋白質生物標誌物。該40組檢測包括促炎組1 (K15049D)、血管損傷組2 (K15198D)、血管生成組1 (K15190D)、細胞因子組1 (K15050D)、趨化因子組1 (K15047D)。本研究包括30例患者的治療前血清樣本。這些檢測是按照製造商的說明進行的。

統計方法

使用癌症基因組圖譜數據庫和膠質母細胞瘤生物發現門戶(GBM-BioDP)對潛在的生物標誌物進行分析，這是一個免費訪問的網絡資源，包含膠質母細胞瘤TCGA數據的子集，並支持詳細查詢和結果數據的交互式顯示[15]。多重分析結果導出為R統計編程語言，用於進一步分析[16]。首先將數據歸一化為z分數，將數據的均值調整為零，將標準差調整為1。用皮爾遜相關法對特征強度的相關進行評估。使用BioDP軟件生成熱圖分析，用於可視化相關矩陣，Kaplan-Meier圖，比較預後指數與總生存率。

為了尋找屬性之間潛在的多重共線性，使用皮爾遜相關法建立了成對相關矩陣。數據以相關圖顯示，正相關和負相關分別以藍色或紅色顯示。數據點(圓)的強度和大小與相關係數成正比。相關係數在p≤0.05時被稱為顯著，圖中僅顯示顯著值。

根據炎症、血管生成、免疫細胞、趨化性或急性期反應特征，對40個複雜基因進行功能分組分析，篩選出10個臨床相關分子的生物標誌物亞群。根據內部變異程度、與其他生物標記物缺乏共線性以及臨床興趣，從每個功能組中選擇兩個基因。方差計算使用Excel中的VARPA語法。

采用多變量Cox比例風險法分析總生存率(OS)、基因表達和切除狀態作為協變量之間的關係。在Cox模型[17]中，通過回歸係數對每個基因的表達進行加權平均，計算多基因預後指數。簡單地說，通常用預後指數(PI)，也稱為風險評分，來生成風險人群。PI被稱為Cox模型的線性分量，PI= β 1 × 1+ β 2 × 2+…+ β pxp，其中xi是表達式值，β I可以通過Cox擬合得到。每個β I都可以解釋為一個風險係數。在使用“生存”包裝時進行裝配。風險組按PI中位數(值越高風險越高)的順序進行二分，每組樣本數量相等。對於得到的兩組，然後執行Kaplan-Meier曲線，根據使用R的中值對表達式值進行二分。

結果

在此之前，Nijaguno等人表明，18種細胞因子的血清特征可以將GBM患者與正常健康誌願者[18]區分開來。為了進一步說明這一點，我們使用了中尺度診斷40 plex ELISA，包括一組趨化因子、細胞因子、血管生成、血管損傷和促炎症標誌物，以確定細胞因子特征是否可以區分GBM[19]患者的短期和長期幸存者。BioDP程序用於探索癌症基因組圖譜(TCGA)數據庫，以確定這些生物標誌物是否典型地存在於GBM[15]患者的樣本中。

如圖1A中的分層聚類(HC)所示，40個MSD生物標誌物中有30個映射到TCGA中的已知基因，並將30名患者分為兩個主要聚類。左側聚類(紅色條)樣本數量較多，屬於經典和前神經細胞，右側聚類(藍色條)樣本較多，屬於間質細胞，神經亞類分布於整個[3]。這30個生物標誌物的值被用來創建預後指數(PI)，並使用Kaplan-Meier分析與總生存率進行比較。在左側的大部分圖中(圖1B)，整個隊列中PI低於中位數的患者比PI高於中位數的患者活得更長(HR 1.8, p=0.001)，即使按年齡和MGMT狀態分層也是如此。同樣，在每個Verhaak亞類中，PI低於中位數的患者壽命更長，具有高度統計學意義(範圍p=0.0001-0.011)。這一發現的含義是，細胞因子生物標誌物可作為GBM患者生存的預後標記。在接受VPA/RT/TMZ治療的2期研究(NCI-06-C-0112)的37例患者中，有30例患者有足夠數量的存儲樣本，並用於驗證預後指標。這些患者的臨床人口統計學如表1所示。大多數患者為男性，均行大體全切除，Karnofsky評分> - 90。在治療開始前，從每個患者收集的樣本中提取細胞因子水平，使用MSD測定法處理，圖2顯示了四個生物標誌物的代表性值。 The data from the entire 40-plex biomarker panel are included in Supplemental table 1. In this VEGF-related grouping there is no significant finding for any one molecule. Importantly, the samples are graphed by order of accrual and we show that the time at -20°C storage does not introduce degradation of our biomarkers as both early and late collections had similar range of values. These data suggest that the biomarkers are stable over time at -20°C and that no individual protein can be used as a predicative biomarker.

	特征	n	％
年齡(y)	54.3(範圍:31.8 - -71.5)
性	男性	22	73
	女	8	27
戰	3.	11	37
	4	12	40
	5	2	7
	未知的/失蹤	5	17
切除	GTR	16	53
	STR	13	43
	活組織檢查	1	3.
KPS	中位數	90
	範圍	80 - 100
腫瘤位置	額葉	10
	顳葉	8
	頂葉	7
	枕葉	1
	額顳葉	1
	Frontoparietal	0
	顳頂	0
	Parieto-occipital	3.
	Temporo-occipital	0

表1:臨床研究預處理特征。
納入研究隊列患者的臨床特征采用RPA=遞歸分區分析，GTR=全切除，STR=次全切除，KPS=Karnofsky評分。

雖然我們在圖1中顯示了30倍的數據可以預測總生存率，但對個別患者使用40倍作為護理點試驗的成本將令人望而卻步。為了減少生物標誌物的數量，我們評估了靶點之間的共線性，並從進一步分析中剔除了具有高共線性的生物標誌物。相關變量如圖3所示。正相關用藍色表示，負相關用紅色表示。顏色強度和圓的大小與相關係數成正比。p值(p>0.05)稱為不顯著，空細胞表示不顯著對。為了進一步減少靶分子的數量，我們將剩餘的分子按功能分類，包括炎症、血管生成、免疫細胞、趨化性和急性期反應。從每一類中選擇兩種內部方差較高的生物標誌物進行進一步的多變量分析，包括:白細胞介素7 (IL7)、腫瘤壞死因子α (TNFA)、血管細胞粘附蛋白1 (VCAM1)、血管內皮生長因子(VEGF)、白細胞介素10 (IL10)、前白細胞介素16 (IL16)、白細胞介素8 (IL8)、c- c motif趨化因子22 (MDC)、c-反應蛋白(CRP)和血清澱粉樣蛋白a (SAA)。然後使用TCGA數據庫對這10個生物標記進行評估，以確定該亞組是否也可以預測GBM患者的臨床結果。我們發現，即使按年齡和MGMT狀態分層，10蛋白預後指數在所有隊列中都是顯著的(p=0.0001-0.012)，(圖4)。這些數據表明，在使用TCGA數據集時，僅使用10蛋白麵板保持了更大麵板的預測能力。

圖1:TCGA中40個生物標誌物的分析。
A)對中尺度診斷V-plex ELISA平台中包含的40個生物標誌物中的30個TCGA GBM基因表達數據進行分層聚類。亞型:C=經典型，M=間質型，P=前神經型，N=神經型。
B)基於從選定的30個生物標誌物隊列生成的預後指數的Kaplan-Meier圖，顯示通過使用全隊列和Verhaak等人[3]得出的差異。分類子類。多因素分析包括預後指標、年齡和MGMT狀態。

圖2:生物標誌物表達值的選擇。
血清中四種生物標誌物VEGFA, VEGFC, VEGFD和TIE2的表達隨機從中尺度診斷V-plex ELISA平台的40種生物標誌物中選擇。數值以pg/ml為單位，樣品按收益順序排列。

圖3:40個生物標誌物的共線性分析。
ELISA平台檢測的40個生物標誌物共線性矩陣。正相關性和負相關性分別用藍色或紅色顯示。較深的藍色和紅色表示高可變共線性，較淺的顏色表示低共線性。這些數據點(圓)的強度和大小與相關係數成正比。相關係數在(p≤0.05)處為顯著值，圖中僅顯示顯著值。

圖4:TCGA中10個生物標誌物隊列分析。
A)熱圖顯示按方法所述選擇的10個生物標誌物的層次聚類，用功能相關性表示。亞型:C=經典型，M=間質型，P=前神經型，N=神經型。
B)基於10個生物標誌物生成的預後指數的Kaplan-Meier圖顯示了整個隊列，並由Verhaak等人[3]子類分開。多因素分析包括預後指標、年齡和MGMT狀態。

接下來，我們用30個臨床標本測試了10種蛋白質組合預測總生存率的能力。如圖5A所示，VCAM1、IL8和IL16與總生存率呈正相關，但均無統計學意義。然而，如圖5B所示，當使用來自所有10種蛋白質的預後指數時，中位數將該組分為兩組，其生存率不同，盡管沒有統計學意義。存活時間較長的隊列的值低於中位數，提示炎症/血管生成腫瘤較少。除年齡和MGMT狀態外，如前所述，第三個預測臨床結局的臨床特征是腫瘤切除量。在我們的30例患者隊列中，15例患者進行了大體全切除(GTR)， 14例進行了次全切除(STR)， 1例進行了活檢，沒有進一步研究。如圖5C所示，在有GTR的患者中，預後指數將患者分為兩組，生存率有統計學上的顯著差異。PI低於中位數的患者存活時間最長。這在患有STR的患者中沒有重複(圖5D)。這些數據表明，一組血清蛋白可能有助於預測未來的臨床結果。 This would need to be confirmed in a larger clinical cohort.

圖5:10個蛋白質生物標誌物隊列預後指標的驗證。
A)使用當前研究的GBM隊列估計10個生物標誌物的Cox比例風險。圖中顯示了包括置信區間和p值在內的風險比。使用GBM患者10個生物標誌物預後指標的Kaplan- Meier圖按B)總生存期和切除狀態分組C)大體腫瘤切除(GTR)和D)次全切除(STR)。

討論和結論

由於與膠質母細胞瘤診斷相關的臨床結果普遍較差，通過個性化藥物最大化治療效果的努力集中於開發具有臨床潛力的生物標誌物特征分析。通過TCGA數據庫識別與存活相關的轉錄組特征和基因組特征，可以區分快速發展和緩慢發展的GBM，這為開發新的預後分析方法找到了有前途的方法[20,21]。最近的一項研究也使用TCGA數據庫將共識基因簽名與藥物一致性聯係起來，以確定具有更有效GBM治療潛力的新的臨床前藥物[22]。在當前的研究中，十個血清可溶性蛋白生物標誌物被發現可以預測TCGA隊列的臨床結果，並與接受腫瘤全部切除並接受常規RT和同時TMZ治療並添加VPA的患者的總生存率相關。未來的研究應該在這些發現的基礎上進行擴展，以測試我們的10個蛋白質生物標誌物麵板是否可以預測在沒有同時給予VPA的情況下接受腫瘤全部切除和常規RT和TMZ治療的GBM患者的總生存率。

需要循環生物標誌物來改善GBM的診斷和臨床評估。目前還沒有這樣的診斷方法，盡管最近有一些臨床試驗旨在解決這一混雜物[23]。雖然GBM的預後分子標誌物已經被確定，但它們主要依賴於原發腫瘤[6]的組織活檢。由於易於采樣，血液中分泌的蛋白質組生物標記物的開發比組織來源的基因組和轉錄組生物標記物具有優勢。目前的研究證明了這種方法的實用性，使用了一種商業化的多重ELISA檢測方法。最近的其他研究也集中於開發具有潛在診斷、預後或預測價值的GBM循環生物標誌物[8]。

生物標記物也可能在治療後環境中發揮重要作用。放療和全身治療可能導致偽進展或放射性壞死，很難與腫瘤生長區分開來。目前沒有任何影像學檢查能準確區分這些實體，組織學診斷仍然是金標準。然而，由於腫瘤位置或功能狀況的原因，並不是所有患者都可以再次切除。在那些符合條件的患者中，再切除可能與顯著的發病率相關，可能由於抽樣誤差而提供不確定的結果，在許多情況下被證明是不必要的。在沒有侵入性手術的情況下可以證明腫瘤複發的生物標記物將改善手術患者的選擇，對難以觸及的腫瘤進行更準確的診斷，並限製接受不必要手術的患者數量。我們的研究證明了未來基於蛋白質組生物標誌物的檢測對GBM腫瘤的臨床評估產生積極影響的可行性。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:斯普羅爾·M, Mathen P, Miller CA, Mackey M, Cooley T，等(2019)血清蛋白質組學特征預測膠質母細胞瘤患者的生存。生物化學分析4(1):dx.doi.org/10.16966/2576-5833.117

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出版的曆史:

收到日期:2019年10月01

接受日期:2019年10月22日,

發表日期:2019年10月26日,