摘要

本研究闡述了一種堿性蛋白酶的純化和動力學表征從UV-90突變菌株枯草芽孢杆菌．采用硫酸銨沉澱、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析四步純化。在最佳條件(pH 8溫度50℃，接種量2.5 mL，發酵時間72小時，酶活95.89 U/mL)下，通過四步純化方案純化2.47倍的蛋白酶，並通過研究pH、溫度和底物濃度對純化酶的影響來表征酶的性質。動力學研究表明K_米和V_馬克斯純化蛋白酶(UV-90)的µM和69.76 U/mL分別為0.03064 M和0.02669 M和56.73 U/mL。這些特點使其在生物技術和工業部門具有潛在的用途。

關鍵字

堿性蛋白酶;枯草芽孢杆菌；淨化;SDSPAGE;二乙基氨基乙基(DEAE)離子交換色譜法;描述

簡介

眾所周知，微生物在工業規模生產細胞內和細胞外酶的技術發展中起著至關重要的作用。為了獲得最大的產品產量，選定的微生物在最佳條件下在發酵罐中生長，並可進一步用於生產酶、奶酪、麵包、生物燃料和其他產品[1]。

生物係統中的大多數反應都需要酶，酶作為催化劑，對生命至關重要。芽孢杆菌是胞外蛋白酶的主要生產者，並在工業規模的發酵過程中頻繁使用枯草芽孢杆菌產生堿性蛋白酶。蛋白酶是由微生物來源產生的主要酶，其中隻有少數被推薦為商業生產者[2]。

枯草芽孢杆菌主要存在於土壤中，又被稱為枯草芽孢杆菌而且草杆菌．它是一種杆狀生物，可以形成堅韌的、具有保護性的內孢子，並能承受極端的環境條件。芽孢杆菌屬專性需氧菌或兼性厭氧菌，包括自由生活菌和致病菌[3]。

在之前的研究中，采用紫外輻照誘變的方法開發了一種高產蛋白酶的突變體枯草芽孢杆菌IBL-04。選擇高生產突變株後，在CCD (Central Composite Design)下，采用響應麵法(Response Surface Methodology)對接種量、培養時間、pH和溫度等物理參數進行優化，以提高蛋白酶的產量。在最適pH 8、溫度50℃、接種量2.5mL、發酵時間72 h[4]的條件下，蛋白酶可大量繁殖。

隨後，研究了影響堿性蛋白酶培養條件、生產力和性能的因素，認為純化和表征堿性蛋白酶具有重要意義。采用硫酸銨沉澱、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析四步純化。通過動力學研究，通過研究pH、溫度和底物濃度的變化對酶活性的影響，探索影響其活性的因素。本論文旨在從枯草芽孢杆菌中純化堿性蛋白酶，並研究其活性的影響因素，以展示其潛在的和可能的工業應用價值。

材料和方法

工作的地方

實驗和分析工作在費薩拉巴德農業大學生物化學係工業生物技術實驗室進行。本研究中使用的所有化學品均為分析級。這些化學品是通過當地代理商從Sigma-USA和Oxide, UK購買的。

微生物

的菌株枯草芽孢杆菌來自農業大學生物化學係工業生物技術實驗室(IBL)和Faisalabad。枯草芽孢杆菌在37°C的營養瓊脂斜麵上培養24 h，然後在4°C保存15天[5]。

蛋白酶的產生

用[6]生產蛋白酶。在CCD(中心複合設計)下，通過響應麵法(RSM)優化培養條件，進一步增強了其有效性。在最適pH 8、溫度50℃、接種量2.5mL、發酵時間72 h[4]的條件下，蛋白酶可大量繁殖。

蛋白酶活性測定

在37°C下，在磷酸鹽緩衝液(pH值為7)中加入酪蛋白，測定蛋白酶活性。用分光光度計在660 nm下測定酪蛋白的氧化。酶活性的表達單位為U/mL[7,4]。

公式:

\[單位/mL\，酶= \frac{{\mu mol\，酪氨酸\，當量\，釋放\倍總量\，體積\，of\，化驗}}{{A \乘以B \乘以C}}\]

A =使用的酶的體積

B =檢測所需時間(20min)

比色測定用體積(1ml)

純化的酶

粗酶經硫酸銨沉澱法處理。從BS-90突變體培養物中獲得粗酶提取物，以8000轉/分離心10分鍾。無細胞的上清/濾液使其達到80%飽和。逐步加入硫酸銨晶體，以達到80%的飽和度。再次置4℃過夜，以8000轉/分離心10分鍾。離心後丟棄上清。沉積物溶解在最小體積為50mm的pH值為7[8]的磷酸鹽緩衝液中。硫酸銨處理後，溶液與試驗緩衝液進行多次透析，使硫酸銨完全鹽析。用分光光度計測定透析前後蛋白酶活性及蛋白含量[8]。

離子交換色譜法:在透析後，通過離子交換層析進一步純化蛋白酶，最終根據分子電荷分離蛋白質。在蒸餾水中加入deae -纖維素樹脂，在95°C的水浴中加熱5小時，連續攪拌，製得deae -纖維素(二乙基氨基乙基纖維素)柱。之後，將柱垂直排列，將準備好的漿液轉移到柱中，並讓柱一夜不受幹擾。然後用30 mL 0.5N NaOH溶液洗滌柱，然後用30 mL 0.5N HCl溶液洗滌柱。1米L solution was then poured into the column with 50 mM phosphate buffer (pH 7). After washing the column was equilibrated with phosphate buffer with a pH of 7 and the adsorbed protein was eluted with a stepwise NaCl gradient prepared in 50 mM phosphate buffer (pH 7). 1 ml fractions were collected wherein eluted fractions were monitored at 280 nm. The peak with the highest protease activity was dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7).Protein concentration and protease activity was determined by routine assay methods [9].

凝膠過濾色譜法:凝膠過濾技術用於檢測由於進入凝膠孔隙而導致的分子保留差異(與大小成反比)。采用[8]法製備Sephadex G-100色譜柱。將離子交換層析後的2 mL蛋白酶樣品裝在Sephadex G-100色譜柱上進一步純化至均一水平。收集pH值為7的50 mM磷酸鹽緩衝液和蛋白酶組分洗脫液，在660 nm處用分光光度計監測吸光度。

蛋白酶的特性

通過研究pH、溫度、底物濃度和k的測定對純化酶的動力學特性的影響_米和V_馬克斯使用Line Weaver-Burk plot[8]。

pH值的影響:為了確定蛋白酶的最佳pH值，將反應混合物在pH為4.0-11.0的緩衝液中孵育15分鍾。孵育後，用標準的測定方法進行酶的測定。所用緩衝液為:醋酸鹽緩衝液，pH 4.0, 5.0;磷酸緩衝液，pH 6.0, 7.0和8和甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液，pH 9.0, 10.0和11.0。

溫度的影響:在進行常規蛋白酶測定以確定蛋白酶活性的最佳溫度之前，將蛋白酶在不同的溫度(即30°C -85°C)下在最佳pH下孵育1小時。

不同底物濃度的影響:在最佳pH和溫度條件下，用不同濃度的酪蛋白在mM中研究了底物濃度對蛋白酶活性的影響，並在1/S和1/Vo與MichaelisMenten (K_米和V_馬克斯)被確定為[10]。

結果與討論

酶的純化

硫酸銨沉澱時，粗提物在4℃下加鹽至80%飽和，得到1.32倍純度。透析純化蛋白酶1.64倍。在二甲基氨基乙基纖維素樹脂製備的色譜柱(陰離子交換柱)中加載樣品溶液。用20- 30ml磷酸鹽緩衝液(pH值7)校準柱，裝2mL粗蛋白酶。然後用Sephadex-100填充凝膠層析柱。DEAE分離的蛋白酶活性組分的純化倍數為1.84,Sephadex柱層析得到的純化倍數為2.47倍(表1)。

美國沒有	淨化步驟	樣品體積(mL)	總酶活(IU)	總蛋白質含量(毫克)	比活度(U/ mg)	淨化褶皺
1	粗酶	300	95.89	18.21	5.26	1
2	(NH4）2所以4降水	30.	93.76	13.43	6.98	1.32
3.	透析酶	29	87.23	10.1	8.63	1.64
4	deae纖維素	28	82.89	8.56	9.68	1.84
5	交聯葡聚糖g - 100	15	76.73	5.89	13.02	2.47

表1:突變菌株UV-90蛋白酶的純化方案枯草芽孢杆菌IBL-04。

整體產量的大幅損失可能與蛋白酶在強酸性培養基中的穩定性較低有關。因此，為了提高產率，可以在適當的pH值下研究色譜技術。因此，必須強調的是，潛水員報告中使用不同策略的純化程序所獲得的產量是極其不一致的，它與每種粗酶和純化酶[9]的特定性質有關。

蛋白酶的表征

pH值對蛋白酶的影響:蛋白酶在4-11的pH值範圍內孵育後使用。突變酶的最適pH值為8.0，而酶在低pH值下活性較低，在堿性pH下活性較高。我們注意到，在包埋[11]後，通過改變酶的確認可以提高酶的活性。

UV-90突變體的堿性蛋白酶在較大的堿性pH值(4-11)範圍內完全穩定，當pH值為7時，其最佳活性為78.73 U/mL，而當pH值進一步升高至11時，其活性呈下降趨勢(圖1)。據報道，芽孢杆菌堿性蛋白酶的最佳pH值在4-11之間變化。我們的結果與[12]報道的蛋白酶活性在pH值7-13範圍內，最佳pH值為10，最佳活性為126 U/mL的結果非常一致。

圖1:pH值對天然蛋白酶活性的影響枯草芽孢杆菌IBL-04和UV-90突變體。

鑒於其他研究者，Johnvesly等人(2002)[13]報道，產生的最佳蛋白酶活性Thermoalkaliphilic杆菌sp．在pH值為11時觀察到JB-99。因此，該酶在堿性條件下表現出穩定的活性。同樣，蛋白酶的性質芽孢杆菌sphaericus菌株C3-41在pH值為11.0時活性最佳。該酶在pH5.0-12.0[14]範圍內穩定。

溫度對蛋白酶的影響:本實驗旨在測定不同孵育溫度(30 ~ 85℃)對純化蛋白酶的影響。觀察到突變的蛋白酶在70°C下穩定。而本地菌株的蛋白酶活性在45°C時最高。從實驗中得出的結論是，在高於70°C的溫度下，酶開始迅速失去其活性(圖2)。對於各種工業應用來說，相對較高的熱穩定性是酶的一個誘人和可取的特性。

圖2:不同溫度對天然菌株和突變菌株蛋白酶活性的影響枯草芽孢杆菌IBL-04。

Haddar等[15]報道，當以酪蛋白為底物時，在25-60°C之間的溫度下觀察到恒定且最高的蛋白酶活性。純化原生堿性蛋白酶的最佳溫度為45℃。大多數報道的蛋白酶在30-85°C[12]範圍內表現出最大速率。蛋白酶殘留活性在不同溫度下測定，在40-50°C時達到最大值，盡管在80°C孵育30分鍾後仍觀察到相當大的殘留活性(50%)[7]。類似地，Johnvesly等人[13]報道了蛋白酶活性的最佳溫度是70℃thermoalkaliphilic杆菌sp．jb - 99。

底物濃度對蛋白酶酶的影響:K_米和V_馬克斯通過改變(酪蛋白)底物的濃度來測定原生和突變的純化蛋白酶。在標準測定條件下測定酶活性，結果用於建立互反圖。

蛋白酶活性的倒數圖(1/V)與各底物濃度的倒數(圖3)_米和V_馬克斯以酪蛋白為底物時，突變純化蛋白酶的µM分別為0.03064 M和69.76 U/mL。而K_米和V_馬克斯原生蛋白酶的µM分別為0.02969和56.73 U/mL。反應速率和底物濃度之間的關係取決於酶對以K表示的底物的親和力_米的蛋白酶[16,17]。

圖3:用於測定天然突變體和UV-90突變體的Km和Vmax值的蛋白酶的線weaver Burk倒數圖枯草芽孢杆菌．

Ahmed et al.[12]報道了催化性能，K_米和V_馬克斯純化堿性蛋白酶的價值枯草芽孢杆菌分別為58 μM和148 U/mL。低鉀酶_米對底物有更大的親和力。堿性蛋白酶具有很強的底物特異性，對酪蛋白作為底物表現出最大的活性。據報道，蛋白酶對酪蛋白作為底物具有較高的水解活性，對BSA和蛋白蛋白分別具有較差到中等水解活性。根據Patel et al.[19]的結果，K_米和V_馬克斯蛋白酶含量分別為0.153 g/100mL和454 U/mL。

結論

從目前的研究中可以得出結論，枯草芽孢杆菌具有良好的蛋白酶活性。該研究還規範了產酶量最大的細菌生長參數，可有效用於商業用途的蛋白酶的大規模生產。測定了uv突變蛋白酶的最佳溫度和pH分別為50℃和8.0℃。用硫酸銨沉澱法、透析法、離子交換色譜法和凝膠過濾色譜法對蛋白酶進行純化。熱嗜堿性蛋白酶因其在高溫、pH和高V條件下的穩定性，將被用於洗滌工業、食品工業和製藥工業的各種用途_馬克斯和底物特異性。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:iiqbal M, Asgher M, Bashir F(2018)枯草芽孢杆菌UV-90突變體堿性蛋白酶的純化和動力學表征。生物化學分析3(1):dx.doi.org/10.16966/2576-5833.112

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出版的曆史:

收到日期:2017年11月21日,

接受日期:2017年12月19日

發表日期:2018年1月04