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氣相色譜/質譜聯用法在脂肪酸臨床調查診斷中的應用進展

梅根·R約翰斯頓1Hany F Sobhi2 *

1美國紐約曼哈頓維爾學院化學係
 2美國馬裏蘭州巴爾的摩市科平州立大學科平有機合成中心自然科學係

*通訊作者:科平州立大學自然科學係，美國馬裏蘭州巴爾的摩21216電話:(410) - 951 - 4113;電子郵件:hsobhi@coppin.edu

摘要

脂肪酸，臨床上稱為有機酸，作為人體必需營養素和代謝物在人體健康中發揮著重要作用。這篇綜述概述了脂肪酸的分類，並證明了它們作為疾病進展表現的生物標誌物在臨床診斷中的重要作用。因此，至關重要的是提出最新的方法學可用於臨床研究。此外，本文還介紹了幾種用於脂肪酸定性和定量分析的分析方法;包括但不限於萃取、衍生化和全質譜分析。綜述了脂肪酸GC/MS分析、脂質提取和衍生化方法在臨床研究準備中的最新進展。

關鍵字

生物標誌物;衍生化;脂肪酸分析;氣相色譜-質譜(GC/MS);血脂

縮寫

必需脂肪酸;脂肪酸甲酯;FFA:遊離脂肪酸;GC/MS:氣相色譜-質譜聯用;TG:甘油三酸酯;PL:磷脂;CE:膽固醇酯;多不飽和脂肪酸;固相萃取


簡介
脂肪酸

脂肪酸在自然界中無所不在，具有多種功能，既遊離又參與複雜的脂質結構[1]。脂肪酸可以根據鏈的長度進行分類:短鏈(<6C)、中鏈(6C- 12c)、長鏈(13C-21C)和極長鏈(>22C)。脂肪酸最常見的鏈長範圍在12C-22C之間;大多數天然存在的脂肪酸含有偶數個碳原子[2]。如圖1所示，它們也可以被描述為飽和或不飽和(有一個或多個雙鍵)。不飽和脂肪酸可以進一步分為兩種可能的構型:順式(其中乙烯基碳的H原子在雙鍵的同一側)和順式反式(乙烯基碳的H原子在雙鍵的兩邊)[3]。除了使用IUPAC的命名法外，脂肪酸還可以用它們的通用名稱(如油酸);通過數值表征(例如:18:0，表示酸含有18個碳，沒有不飽和度);如果適用的話，還可以通過雙鍵的位置。如果表示相對於末端甲基的不飽和程度，則用ω或n;Δ表示雙鍵相對於羧基[2]的位置。表1列出了常見脂肪酸及其相關分類。

圖1:脂肪酸的分類

表1:各種長鏈脂肪酸的命名方式和結構。

脂類的分類

脂質是不溶於水的分子，在細胞內具有多種功能;因此，在生理上是非常重要的。脂類主要分為八大類:脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、丙烯醇脂、糖脂和多酮[4,5]。脂類有三大功能:為細胞提供能量儲存，主要以脂滴中的甘油三酯(TG)和膽固醇酯(CE)的形式存在[6-8];形成細胞脂質雙分子層基質;並在信號轉導和分子識別過程中充當第一和第二信使[8,9]。脂肪酸是生物合成更複雜的脂質結構如甘油三酯和磷脂所必需的主要成分。甘油三酯是中性的能量儲存分子，由一個甘油分子與三個等價物脂肪酸酯化而成。磷脂是膜雙分子層的主要成分，為細胞提供可滲透的屏障，並為一係列蛋白質[10]提供支持。這些主要是非極性脂類生物分子需要各種脂蛋白(脂-蛋白組合)的協助在血液中運輸(圖2)。

圖2:磷脂的特征要麼是鞘磷脂，要麼是甘油磷脂;每個結構不同。甘油磷脂有一個甘油主鏈，兩個酯鍵與脂肪酸相連，一個磷酸酯鍵與極性氨基醇相連。鞘脂有一個鞘醇的主鏈，一個與脂肪酸的酰胺鍵，一個與極性頭基的o鍵。甘油三酯是貯存分子，由甘油主幹和三個酯鍵組成。

生理上的相關性

脂肪酸在生理上起著重要作用;根據細胞過程的不同，脂類會對人體的表現和健康產生消極和積極的影響。脂肪酸功能的負麵影響包括:高血壓、糖尿病[11]、癌症[12]、炎症、敗血症和心血管疾病[13,14]。然而，脂肪酸被用作藥物開發的治療靶點[15,16]。此外，有些脂肪酸對特定細胞過程的成功起著至關重要的作用，並在預防疾病方麵發揮著作用。多不飽和酸(PUFA)，特別是n-6和n-3，統稱為“必需脂肪酸”(EFA)。然而，這些酸不是由人體生物合成的，因此隻能從飲食來源中獲得[17,18]。兩個突出的例子是亞油酸(18:2n-6)[19]和二十二碳六烯酸(22:6n-3)[20]。亞油酸在9和12碳位有順式雙鍵，而共軛亞油酸是各種十八碳二烯酸與(9獨聯體，11反式)是主要的異構體。近年來，共軛亞油酸的抗癌特性已被廣泛認可，特別是在預防乳腺癌[19]方麵。二十二碳六烯酸具有令人信服的治療意義，因為它包含在飲食中與預防許多病理[20]呈正相關。必需脂肪酸在多個過程中起著重要作用，飲食中n-6和n-3脂肪酸之間的平衡至關重要。

花生四烯酸是一種具有代謝活性的脂肪酸;修飾後產生許多脂質介質，如類烯二萜、內源性大麻素和脂質素(圖3)。脂質代謝的中心參與提供了廣泛的生理後果。在生物合成過程中，脂肪酸從儲存形式中釋放出來，在細胞中利用之前被動員起來。Eicosanoids[13,21,22]是一類生物活性脂質介質，包括前列腺素和白三烯。這些分子與疾病的炎症反應有關，如關節炎和哮喘。

圖3:脂肪酸在新陳代謝中被用來生物合成各種脂質結構(例如，甾醇、磷脂、類烯二萜和甘油脂)。

脂肪酸分析

脂肪酸分析在過去的五十年中取得了顯著的進展。在過去的十年中，在萃取、衍生化和分析方法方麵取得了許多進展。本文的目的是對近年來的文獻進行綜述;專注於利用氣相色譜-質譜(GC/MS)分析中鏈和長鏈脂肪酸(特定於大多數代謝物)的貢獻。脂質是一個具有挑戰性的研究領域，主要是由於其結構的複雜性，影響了其後續的分析。此外，缺乏對稀有脂肪酸的內部標準阻礙了它們作為臨床診斷工具的使用。這裏概述的新方法有助於生物醫學研究、生物標誌物臨床診斷和藥物開發。

提取方法

由於其固有的疏水性，脂類可溶於有機溶劑。因此，大多數分離方法包括在不相溶的溶劑之間進行相分離，使脂質分配到非極性有機相中。Folch等[23,24]和Bligh等[25]協議是經典的氯仿/甲醇萃取方法(分別為2:1 v/v和1:2 v/v);後一種方法最適合提取脂質濃度低(<1%)的樣品。在這兩種方法中，組織在加入水之前先用溶劑均勻化，這就形成了一個雙相體係。較低的氯仿層含有來自樣品的脂類，隨後將其分離;含有樣品非脂質成分的混相甲醇/水層。Bligh[25]方法比Folch et al.[26]方法的優點是樣品提取所需的溶劑明顯更少。雖然這兩種方法經常被使用，但被發現是費力和耗時的。此外，LePage等人采用了直接酯交換反應的方法，使用甲醇/苯溶液和乙酰氯4:1。 The main advantage of this methodology is the reduced number of sample preparation steps required for subsequent analysis. Matyash et al. [27] described a methodology utilizing milder and less toxic conditions for extraction, using methyl-叔甲醇中的-丁基醚(MTBE)。在使用這些溶劑條件下，在頂層提取脂類，顯著提高了脂類回收率。

具體的提取工藝取決於所研究的脂類及其最終目的。例如，血液樣本主要由脂肪酸和膽固醇組成;遊離脂肪酸(FFA)隻占生物樣品中脂肪酸總組成的一小部分，需要定製的提取方案將其分離出來進行分析[28,29]。

脂質提取方法研究進展:脂質提取被認為是生物樣品定量分析中最具挑戰性，也是最關鍵的步驟之一。不斷優化脂類提取方法的發展;提供wider-reaching應用程序。本文綜述了近年來脂質提取技術的研究進展及其應用。

甘油三酸酯的提取:在2009年的一項研究中，利用超臨界二氧化碳(SC CO)從初榨椰子油中提取中鏈甘油三酯(MCT)2)．該技術可從樣品中提取99%的油。與傳統的提取方法相比，該方法的收率顯著提高n己烷。研究人員改變了提取溫度、壓力和CO的參數2達到最佳消費條件。隨後用氣相色譜-火焰電離檢測器(GC-FID)對脂肪酸組成進行FAME分析。結果表明，萃取率和MCT含量隨萃取參數的選擇而變化。

磷脂的提取:報道了一種簡單且可重複的脂類提取方法[31]，特別是磷脂和溶血磷脂，稱為“甲醇法”。在渦旋和在冰上孵育之前，向樣品中添加甲醇。離心後直接用ms對上清液進行分析。與傳統方法[32]相比，該方法提取後的磷脂收率較高，無偽影形成。

脂肪酸的提取:對於脂肪酸樣品的製備，一般遵循如圖4所示的步驟序列。為了表征生物基質中脂類的脂肪酸分布，脂肪酸必須首先通過提取和衍生化的常規方法獲得，或者同時獲得原位提取和衍生化[26,33]。傳統上，溶劑提取之前要經過幹燥和消化過程，以允許溶劑滲透和釋放綁定的脂質，分別為[34]。隨後進行純化、水解、酯交換和反應後處理，以製備用於GC/MS分析的樣品。的原位提取和衍生化方法規避了傳統方法的一些限製，如時間投入、消耗大量溶劑、樣本量大和潛在汙染。

圖4:描述分析前脂肪酸樣品製備順序的方案。

血漿:最近的研究通過比較分析探索了各種提取方法的最佳應用。經典的提取方法，以及一種替代方法，利用微波化學，測量了等離子體樣品的製備和分析。Folch et al.[23]方法被發現最適合於提取脂肪酸和測定血漿[35]中常見脂肪酸(如亞油酸、棕櫚酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸)的相對濃度。目前的報告表明，傳統的Folch提取和隨後的甲基化被認為是更可靠的定量脂肪酸從血漿。但與LePage直接方法相比，該方法耗時更大，資源利用率更高。研究還建議應根據目標脂肪酸的性質確定內標的選擇。最近的一項研究比較了Matyash等人[27]方法與經典的Bligh和Dyer氯仿/甲醇法在小血漿樣本上的提取細節。這些方法在回收脂肪酸濃度方麵沒有顯著差異。然而，Matyash等人的[27]方法導致回收的PUFA濃度略高。當提取脂肪含量高(>2%)的樣品時，經典的Bligh和Dyer法效果更好。 The Folch et al. [23] method of extraction was utilized in an Alzheimer’s disease comparative study establishing fatty acid profiles for plasma and brain tissue samples [37]. Plasma lipids were extracted with chloroform/methanol (2:1); followed by saponification, methylation (BH3./ CH3.OH)和GC分析。分析表明，兩種樣品的脂肪酸分布沒有顯著差異。

組織:從組織(和血液)[38]中分離遊離脂肪酸，開發了一種具有高通量應用的快速協議。組織樣本，包括脂肪和肝髒，需要均質步驟作為提取程序的一部分。對脂肪組織、甲醇鹽酸和內標(氘化脂肪酸)進行簡單超聲處理以實現分散(然而，在超聲處理前需要對肝組織進行均質處理)。組織樣本用異辛烷提取，離心分離。有機層被去除並濃縮。提取的脂肪酸隨後用GC/MS負化學電離模式進行分析。為了建立脂肪酸圖譜，並具體評估組織樣本中omega-6與omega-3脂肪酸的比例，描述了一個簡單的過程，將提取和甲基化結合到一個步驟中。用己烷、BF對勻漿組織進行處理3.在甲醇中，並在100°C加熱1小時。數據表明，該方法對長鏈脂肪酸的回收率明顯高於傳統的兩步法。然而，兩種方法之間的相對脂肪酸組成沒有差異。這種簡化的方法更省時，減少了潛在的樣品丟失和汙染。

尿:為了同時定量糞便和尿液樣品中的短鏈脂肪酸和支鏈氨基酸，開發了一種新的衍生化方法[40]。初始提取後，均勻化10 min, 4℃離心20 min。用氯甲酸丙酯在水、丙醇和吡啶(8:3:2 v/v/v)的溶液中一步衍生得到上清。提取完成後，用GC/MS對樣品進行定量。此外，這些條件對糞便樣本進行了優化，但該程序可以成功地應用於血漿和尿液樣本。這種性質的快速方法學有許多臨床應用;即肥胖症和代謝障礙的診斷。

分析方法
脂肪酸的衍生化

在GC/MS分析之前進行脂肪酸衍生化，以便在實際溫度下洗脫極性較低、揮發性較強的分析物，不進行重排或分解[41,42]。通過衍生化修飾官能團使分析化合物成為可能，否則不容易被GC分離。如圖4所示，衍生化通常有兩種方法:從脂質結構中水解脂肪酸，或直接原位脂質結構[42]的衍生化。大多數報道的衍生化過程涉及通過可逆的酯化和酯交換機製將脂肪酸部分轉化為相應的酯。方法在涉及的步驟、所用的溶劑和試劑以及實驗條件[34]方麵差別很大。三甲基氯矽烷(TMCS)衍生化被認為是最簡單的方法之一。分析得到的質譜顯示了M-117的特征離子片段，它代表了(CO2TMS)(43 - 45)。然而，脂肪酸甲酯(FAME)是最常用於分析的衍生物[28,46]。FAME在生物組織中比其他脂肪酸酯的製備更頻繁，因為在GC過程中需要較低的溫度來改變它們的揮發性，從而改善後續分離[33]。

衍生化通常在催化劑存在的情況下進行;以堿性(NaOCH)為特征3.， KOH和NaOH)，或酸性(HCl, H2所以4和男朋友3.)．在甲醇的存在下，酸催化的衍生化反應可使甘油三酯和其他複雜脂類(除遊離脂肪酸外)發生酯交換。然而，堿催化反應不能酯化遊離脂肪酸[42]。與衍生化相關的大多數錯誤(例如，不完全提取和不必要的皂化)都發生在生產後期檢查過程中，因此這一步對於獲得準確可靠的結果[34]至關重要。為了在後續的分析中獲得最佳和準確的結果，研究者必須根據樣品的性質選擇理想的衍生化方法。因此，可以減少或消除潛在的困難，如不完全轉化、對原始脂肪酸剖麵的修改、偽影的形成和汙染[47,48]。

脂肪酸和脂類衍生化方法的研究進展
脂肪酸甲酯(FAME)

利用三氟化硼和甲醇製備FAME是應用最廣泛的衍生化方法之一。然而，由於高爐的毒性、揮發性、成本和有限的貨架壽命，這種方法有幾個缺點3.此外，在合成過程中可能形成的工件也是一個問題。這些副產物有助於降低選擇性和增加分離時間。因此，采用一種聲稱減少反應時間的方法對於減少副產物是至關重要的[50,51]。傳統上，FAME的合成是在使用催化劑的熱水浴中進行長時間的。微波輔助有機合成(MAOS)是一種利用樣品分子吸收電磁輻射的現代合成方法;最終將其轉化為熱量。與傳統加熱方法相比，該技術具有顯著優勢，如縮短反應時間、減少副反應、提高回收率和整體改進的重現性(這些都是分析臨床樣本的關鍵因素)。在過去的幾十年裏，微波在合成中的應用得到了廣泛的應用[49,52-54];微波輔助衍生化(MAD)是FAME合成的一個具體應用[51,55-58]。2013年，Lin提出了利用微波輻射[59]直接從人血清樣品中提取脂肪酸的酯交換反應。 The samples were extracted using a methanol/hexane/acetyl chloride solution based on LePage et al. [26] protocols. Fatty acid profiles obtained for the serum samples subjected to microwave-assisted FAME production (100 °C for 1 min in single mode or 125 °C for 5 minutes in multimode) were compared to profiles of samples where derivatives were obtained using traditional conductive heating (60 min at 100 °C). Fatty acid recoveries of the two sample groups were found to be quantitative or nearly quantitative. The one-step direct transesterification methodology was concluded to be accurate and comparable to the traditional LePage et al. [26] approach. Expedition of the derivatization process could prove beneficial for biotechnology applications where high-throughput analysis is paramount. A study of fatty acids in human plasma by Masood et al. [60] outlined two modifications of standard FAME analytical techniques, which would allow for the implementation of high-throughput analysis. The first modification related to the derivatization procedure, which was simplified to one step based on the LePage et al. [26]transesterification method. All required reagents were combined into a stock solution that was administered simultaneously; eliminating several laborious and time-intensive postreaction steps which characterize the traditional methodology. Due to the simplicity of this modified procedure, automatic robotic derivatization reactions were also explored. Results from the modified one-step method and the automated variation of onestep method were quantitatively similar to results obtained using the original LePage et al. [26] method, where differences for major fatty acids were minimal.

常用方案(如三甲基氫氧化銨(TMSH)， KOH, BF)的效率3.在己烷/甲醇，甲醇鹽酸和BF中3.與甲醇氫氧化鈉)用於FAME衍生化[36]。這項工作的結論是，hcl催化的衍生物產生了不同種類脂肪酸鏈長度和功能的完整轉化(>80%)。使用TMSH的酯交換導致PUFA的衍生不足，而KOH程序未能衍生FFA，和BF3.在己烷/甲醇中不能衍生出膽固醇酯。土壤細菌中含羥基和環丙烷脂肪酸的分析方法Sinorhizobium meliloti，進行了評價和優化[61]。評估的三種方法是:a)甲醇中使用KOH的堿式酯交換反應;B)使用硫酸和甲醇的酸催化轉甲基化，c)甲醇中使用甲氧基鈉的堿催化轉甲基化。該研究還介紹了適當的分析標準，以監測衍生化過程中的回收和損失。數據表明，雖然這三種方法總的來說能產生相當數量的脂肪酸，但在3-羥基和環丙烷脂肪酸的回收中觀察到顯著的濃度差異。堿性條件(甲醇中的KOH)對3-羥基脂肪酸的回收效果最好，而堿催化的轉甲基化對含環丙烷的脂肪酸的回收效果最好。本研究中磷脂的衍生化策略如圖5所示。

圖5:n -三甲基n -甲基三氟乙酰胺(MSTFA)對磷脂的衍生化反應[61]。

Trimethylsilyldiazomethane (TMSDM)

TMSDM是一種市售的甲基化試劑，已與甲醇作為衍生劑用於製備FAME[42,62]。該試劑通常被用作重氮甲烷(DM)的替代品[47,63]，因為考慮到DM的安全性、毒性和保質期[64]，DM的使用受到限製。關於羧酸酯化機理的細節，直到2007年的報告才有所披露。利用同位素標記技術確定了tmsdm催化的羧酸酯化過程原位引入甲醇後重氮甲烷的釋放[65]。TMSDM是一種常用的衍生劑。然而，最近報道了TMSDM的一些缺點，如反應速率較慢[64,66]和與DM衍生化相比收率較低[64]。此外，脂肪酸三甲基矽酰化引起的偽影也有報道[48,63]。

Pentafluorobenzyl溴化(PFBB)

五氟苯溴(PFBB)是一種常見的脂肪酸衍生劑[67]。用這種試劑，生成了鹵基五氟苯酯。有報道稱，在分析複雜脂類分析之前，使用PFBB對脂肪酸樣品進行衍生化[38,68]。

色譜法

在許多應用中，使用氣相色譜法表征脂肪酸譜的研究都有優先權[3,46,69]。一般來說，樣品注入後，載氣推動樣品通過含有固定相的柱，固定相通常由聚合物結合的二氧化矽或氧化鋁製成。樣品的分析物的分離是基於與固定相的相互作用程度，以及分析物沸點的差異。樣品組分理化性質的差異導致其保留時間的差異。分析物的身份可以僅根據保留時間來確認;但是，為了更準確的識別目的，可能需要MS。根據樣品的性質，有許多參數可以改變，以確保適當的方法開發(例如，載氣、流速、柱長和直徑、固定相、柱的溫度和注射技術)。對於脂肪酸的氣相色譜分析，各種不同性質的柱是可用的。極性柱最常用於脂肪酸的分析;以熔融二氧化矽、聚酯、氰丙基聚矽氧烷等常用作固定相。 Polar stationary phases allow for separation of fatty acids with different chain lengths, degrees of unsaturation (and their constitutional and geometrical isomers). Generally, the greater the length of the column, the better the separation of analytes in a sample. When the stationary phase has comparable polarity to the sample, increased resolution and separation will be exhibited, with a reduction in runtime [70].

先前的GC/MS方法已被報道用於脂肪酸的分析[71]。酸樣用雙(三甲基矽基)-三氟乙酰胺(BSTFA)和TMCS(99:1)衍生。將得到的TMS衍生物注入到溫度設置為280°C的分流注入器中。毛細管柱為30 × 0.25 mm， μ m為0.25 m。將烘箱溫度設定為80 ~ 150℃，速率為30℃/ min(超過2.5分鍾)，然後從150℃到280℃，速率為5℃/ min(超過30.0分鍾)，最後在280℃保持10.0分鍾。毛細管柱固定固相通常由矽結合聚合物製成，具有極性激活表麵，氦氣作為移動相載氣;流速為1.5 mL/min，電子電離設置為70 eV，熱源設置為230°C[71]。氣相色譜分析具有顯著的分辨率、高靈敏度和可重複性結果[72,73]。此外，可對衍生或天然脂肪酸樣品進行脂質分析。然而，最近的報告[74,75]表明，鏈長較長的脂肪酸需要衍生化才能獲得最佳結果。高效液相色譜法是一種額外的方法，在脂肪酸分析方麵使用較少。

脂肪酸分離方法的研究進展

氣相色譜的複雜分辨能力已被用來分析複雜樣品。2006年報道了脂肪酸譜分析;提供了各種樣品中共軛亞油酸總含量的數據[41]。用氰基矽酮毛細管柱分離密切相關的異構體。具體的異構體鑒定主要基於保留時間的比較，因為市售標準有限。

氣相色譜法與FID或eie - ms檢測器是研究脂肪酸最常用的分析方法。然而，一維氣相色譜法並不總是從複雜樣品中闡明脂肪酸譜的最佳選擇。二維氣相色譜(GC/GC)是一種相對較新的技術，由於分離力強，能夠成功地分離複雜的脂肪酸混合物;提供了一種替代方法，可以規避目前FAME分析的一些局限性。GC/GC分離過程通常在兩個極性不同的柱上進行;傳統的柱結構包括非極性第一相和極性第二相[76]。2011年[77]對海藻中衍生化多不飽和脂肪酸進行了二維氣相色譜綜合分析。本研究專門評估了極性離子液體固定相在一維GC-MS和二維色譜(用作二次元)中的效用。此外，還與各種傳統的固定相組合物進行了極性、靈敏度和柱漏程度的比較。結果表明，離子液體色譜柱具有較強的極性，且比其他極性色譜柱漏液少，具有較好的檢測性能。 One-dimensional analysis using the ionic liquid column provided detailed fatty acid profiles, leading to the characterization of the algae samples. However, the high selectivity provided by the ionic liquid phase used in GC/GC, combined with mass spectral detection, made it possible to identify more compounds which were co-eluting in one-dimensional GC.

為了將糖尿病(T2DM)患者從健康人群中診斷出來，采用2d氣相色譜/飛行時間質譜(GC/GC - tofms)對血漿中的代謝物進行了鑒定[78]。使用傳統的一維氣相色譜法分析複雜的代謝物樣品，由於峰重疊，在分辨率方麵存在問題。在這種情況下，二維氣相色譜結合TOF-MS檢測器和峰值分析軟件導致了複雜樣品的特殊分析物分離和生物標誌物識別。包括亞油酸和棕櫚酸在內的5種代謝物被確定為潛在的生物標誌物，因為它們在2型糖尿病患者中的水平高於健康受試者。在這裏報道的方法學有潛力用於臨床診斷，對一些生物學應用。

Manzano等人[76]報道了從複合樣品(包括亞油酸和亞麻酸異構體)中分離和鑒定FAME。建立了毛細管流動技術調製器配合FID檢測的二維氣相色譜體係。方法優化包括探索不同的柱組合(常規和倒置相集)和第二次元的柱長度，以評估優化結果。參數如烘箱溫度，調製時間和柱流量也進行了評估。當使用倒置相柱組合時，觀察到更大的FAME分離。此外，當二維(倒置相位)長度越短時，分辨率和分析時間越長。該報告還吹捧了在不到一小時內首次分離亞麻酸的八種異構體。

評價了兩種GC-FID方法測定乳製品中遊離脂肪酸的性能[79]。具體來說，評估了直接柱上方法和衍生化方法(其中FFA在注入器中衍生化);後一種方法被認為更健壯。由於衍生化步驟的自動化潛力，這種方法顯示了更多的日常使用機會。直接注射法檢測和定量水平較低。此外，用柱上直接注射法觀察了脂肪酸的吸收和柱降解。

固相萃取:除了氣相色譜分離，還需要考慮預注射製備分離。樣品的製備是分析中至關重要的一步，因為生物樣品基質可能會幹擾待檢代謝物的分析。雖然有許多不同的分離方法，固相萃取(SPE)色譜法仍然是製備分離粗脂混合物最有用和最實用的技術之一。固相萃取(SPE)有時與其他製備步驟一起使用，作用是對複雜混合物進行分餾，然後將其濃縮為更易於管理的樣品(圖6);這樣就能進行更精確的分析和脂質分析。根據樣品的性質，固定相和載氣都可以被修改。柱通常是預先包裝的，具有廣泛的可變規格[9,80]。

圖6:固相萃取概述，解釋了樣品製備和分析前重構的步驟順序[80]。

最近的出版物報道了固相萃取方法的應用和進展。在2008年的一項研究中，固相微萃取(SPME)方法用於樣品分離，然後進行分析。用SPME，一種塗有萃取相的纖維被應用到樣品上，吸收感興趣的分析物。萃取後的纖維被轉移到分離儀器的注入口，分析物在此發生解吸;隨後進行了分析。SPME是一種簡單、快速的技術，不需要使用溶劑。本方案使用2ml樣品，與吸收纖維(二乙烯基苯/羧基/聚二甲基矽氧烷)接觸加熱，以捕獲揮發性分子。隨後進行解吸分析[81]。

尿液樣品的分析過程一般需要使用固相萃取法，以優化樣品中的脂肪酸濃度。SPE方法被用於探索新的生物標誌物，特別是在生物標誌物發現研究中調查尿液樣品中脂肪酸的分泌時[82]。首先用甲醇激活固相萃取管，然後用2%的醋酸進行平衡。尿液樣本裝入後，用甲醇/醋酸溶液清洗色譜柱;脂肪酸最終被丙酮洗脫。另一項研究[83]報道了硝基烯烴代謝物的表征和定量，特別是9-硝基十八烷- 9,11 -二烯酸和12-硝基十八烷- 9,11 -二烯酸。提取前，尿液在10 mM Hg中孵育2Cl230分鍾。

報道了不同吸附劑在萃取組織脂肪酸分析中的固相萃取效果。脫水二氧化矽、水合二氧化矽和氨丙基結合二氧化矽(NH2)在不同條件下進行評估。結果表明，水合二氧化矽基質對極性脂類的回收效果最好。此外，提高脂質與吸附劑的質量比可以提高極性脂質的回收率[84]。

質譜分析

脂質表征包括定量和定性質譜分析。脂質分析提供了與粗提取物中所含脂質組成和豐度有關的數據，可用於檢測隨時間的波動[9,34]。多種不同的MS電離源(例如，電子電離(EI);化學電離(CI);基質輔助激光解吸電離(MALDI)電噴霧電離(ESI);和快速原子轟擊)是可用的，這取決於樣品狀態的性質(固體、液體或氣體)[9]。EI和CI一般用於氣體和揮發性有機分子的分析，而MALDI和ESI可用於液體和固體的分析。根據具體的應用情況，每種電離方法都有其固有的優缺點。還有許多質量分析儀，如三重四極子(QQQ)，離子阱，飛行時間(TOF)。 In general, after injection, the sample is bombarded with a stream of electrons, resulting in the formation of charged fragment ions. These fragments are then separated based on their mass to charge ratio (m/z). After detection, the resulting spectra present the relative abundance of the detected ions as a function of their mass to charge ratio. Characteristic fragmentation patterns are observed for fatty acids, specifically FAME, with ions of m/z=74 (McLafferty rearrangement ion from ester moiety), m/z=43 (isopropyl cation), and m/z=41 (propenyl cation) [85].

除了MS分析，還有其他的檢測方式，如火焰電離檢測和熱導檢測。FID檢測已廣泛應用於法醫應用和調查科學。它的主要用途是分析碳氫化合物，不能產生含羰基化合物的離子[86,87]。用質譜檢測的氣相色譜分離提供了高的色譜分辨率和結構確認(圖7)。這種配對通常比其他檢測模式具有更好的靈敏度和選擇性[88]。GC/ MS被強烈推薦用於臨床和有機酸分析，因為它能夠區分不同脂肪酸的立體異構體，這是其他檢測手段無法做到的。

圖7:TMS衍生2,6-二甲基庚酸氣相色譜質譜分析在電子衝擊(EI)條件下運行。樣品的GC保留時間為11.14分鍾;母離子的MS為m/z=215，其正離子碎裂顯示[71]。

脂肪酸與脂質質譜方法研究進展

氣相色譜-質譜聯用是目前應用最廣泛的脂肪酸分析方法。它的流行程度可以從當前許多報告的使用中看出[89,90]。瑞舒伐他汀治療對健康患者血漿樣本脂質譜的影響已有報道[91]。采用超高效液相色譜四極杆飛行時間質譜法(UPLC/Q-TOF)，建立了一種簡便、高效的檢測和鑒別多類脂類的方法。該方法包括建立和實現磷脂酰膽堿保留時間指數，這有助於鑒別。研究結果表明，由於瑞舒伐他汀的使用(血漿收集在藥物峰值水平)，檢測到的脂類，即鞘磷脂、甘油三酯、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺的濃度顯著降低。雖然在藥物治療後觀察到幾種脂質水平的變化，但本研究不能確定因果關係。

一個小瓶方法，樣品大小減少100倍，評估了堿性催化的磷脂衍生化Sinorhizobium meliloti樣品[61]。使用含200µL插入物的GC/MS小瓶進行衍生化和後續GC/MS分析;不需要額外的儀器或修改。最近的研究結果表明，微尺度方法是可複製的;提供定量的收益。這種實用的方法需要最小的樣本操作，並適應大的樣本數量。研究還表明，在較高的溫度下進行的反應是導致產物生成損失增加的原因，很可能是由於副反應。水解，這是一個典型的關注與減少樣本量，似乎沒有影響轉化。

為了研究腸道疾病的病理，使用一種新的、高靈敏度的方法來定量磷脂酰膽堿[92]。粗提物分析采用納米電噴霧電離串聯質譜與三重四極杆質譜聯用。該方法允許直接分析粗提取物和定量小濃度，大多數臨床技術由於其局限性不能識別。

質譜的最新進展，特別是MALDI成像質譜，已經導致了組織切片的脂質分析，甚至單細胞樣本[93-95]。這種方法允許費力的脂質分離和提取過程的環球航行，提供原位分析(96 - 98)。采用GC-MS對種子提取物中的脂肪酸進行鑒定和定量[99];報告了單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的相對百分比。結果表明，ω-亞麻酸是一種ω- 3脂肪酸，在種子提取物中含量最高。這種脂肪酸存在於所有被分析的種子中，除了芝麻;其中奇亞籽和亞麻籽的發病率最高。研究還表明，種子中多脂肪酸的濃度高於飽和脂肪酸。

目前的工作是探索減少脂肪酸GC/MS分析時間的方法;提供高通量調查的可能性[100]。一種使用氣相色譜-串聯質譜(GC-MS/MS)和氨誘導化學電離的最新方法被開發出來，並用於評估紅細胞中的脂肪酸譜。該方法的總運行時間為9分鍾，而傳統GC-MS/MS方法的分析時間為40 - 60分鍾。此外，與電子電離碎片法相比，這種利用化學電離的方法產生更高的分子離子產量，而電子電離碎片法通常隻產生片段離子，而不產生分子離子。這增加了複合特異性，從而增加了識別的信心。

同位素分析方法是近年來發展起來的，可在豐度水平上獲得精確的同位素組成。當同位素比質譜(IRMS)與氣相色譜耦合時，可以對樣品中的同位素比例進行靈敏的檢測和測量。這種方法提供了可靠的分析，是使用放射性示蹤劑的一種安全替代方法[101]。最近對有機物和脂肪酸的分析使用IRMS來定量特定的代謝物[70,102]。

生物標記物

生物標誌物在量化各種病理的存在和進展中起著重要作用;除了評估潛在的治療應用。因此，這一研究領域的進展是必要的，因為它有助於疾病的早期診斷和預防。例如，棕櫚油酸受雷帕黴素(mTOR)信號通路的機製靶點調控;抑製mTORC1可降低外周血單個核細胞(PBMC)中的棕櫚油酸水平。因此，mTORC1可能通過控製棕櫚油酸的生物合成來調節棕櫚油酸的水平。棕櫚油酸升高被用作多發性肌炎患者PBMC異常的指標。最新的研究結果推薦這種生物標誌物用於多發性肌炎的早期檢測和治療[103]。

基於FFA在癌症發展中發揮作用的證據，這種脂類被用作區分患者癌症和非癌症狀態的生物標誌物[104]。檢測了腺癌患者和非已知癌症患者的血清樣本。與非肺癌患者相比，肺癌患者的花生四烯酸和亞油酸水平被觀察到升高。血清FFA和代謝物對肺腺癌的診斷具有良好的敏感性和特異性。基於ffa的生物標記物的一個優點是它們是穩定的;具有較高的臨床預測價值。2017年的一項研究[105]發現，氨基戊二酸和各種代謝物是黑色素瘤的潛在生物標誌物。癌症形成、進展和治療進展的證據是這些報道的分子關係的潛在應用。脂質譜分析采用GC/MS和直接輸注質譜(DI-MS)進行。代謝圖譜用於區分診斷為卵巢病變的患者的不同癌症類型[70]。 Human tumor samples were analyzed by GC-TOF MS to provide signatures for patients diagnosed with invasive carcinoma and borderline tumors. Known primary metabolites, which included free fatty acids (e.g., nonadecanoic, stearic, heptadecanoic, and malic acid) were quantified. Approximately 40% were successfully identified using mass spectral comparison and retention times relative to reference compounds. Significant differences in metabolic profiles were found between tumor types after extensive statistical analysis. Specifically, the level of malic acid was elevated in patients suffering from invasive carcinoma, while the levels of stearic, heptadecanoic, and nonadecanoic acids increased in samples from patients diagnosed with borderline tumors. This methodology is a promising predictive model for high throughput tumor diagnosis; able to distinguish between 90% of tumor types. Experiments on blood plasma have validated the viability of this technique to quantify endogenous levels of free fatty acids and monoglycerides.

目前的研究表明，心血管健康和特定脂肪酸水平之間存在一致的相關性，表明它們與心髒健康的生物標誌物相關。2013年的一項研究[106]報告了心血管疾病與脂肪酸水平之間的反比關係。磷脂脂肪酸包括15:0,14:0和反式-C16:1n-7可能是膳食脂肪和心血管疾病發病率的生物標誌物。數據顯示，15:0脂肪酸與心血管疾病發病率呈負相關，而14:0和14:0脂肪酸與心血管疾病發病率無相關性反式-C16:1n-7。高水平的15:0脂肪酸與較低的血壓、較低的甘油三酯、較低的心血管疾病和冠心病發病率有關。此外，在一項類似的研究中，研究了多不飽和n-3脂肪酸(特別是EPA和DHA)與炎症標誌物之間的關係[107]。在毛細管氣相色譜法評估前，血液樣本衍生至FAME。結果顯示，EPA和DHA水平與炎症生物標誌物c -反應蛋白(CRP)和白細胞介素-6 (Il-6)之間呈負相關。這些數據表明，脂肪酸在通過減少全身炎症來預防心血管事件方麵具有預防作用，並可作為一種生物標誌物。

肝纖維化樣本的代謝譜在2017年的一份報告中建立[90]。生物標誌物可能被證明在使用靶向藥物開發的治療和最終預防中具有重要意義。四氯化碳被用來誘導大鼠樣本的肝損傷。采用GC/MS分析建立模型組和對照組的代謝譜。對數據的分析表明，接觸有機溶劑會導致曲線的顯著波動，影響代謝途徑。針對血清樣本中的7種代謝物;五個來自尿液樣本。與對照組相比，模型組大鼠血清中異亮氨酸、l -蘋果酸、α-銅和馬尿酸水平升高;與對照組相比，模型組大鼠尿液中2-羥基丁酸、異亮氨酸和皮質激素含量增加。作者推斷，肝纖維化與許多代謝途徑的功能障礙有關。 Wang et al. [108] were able to distinguish between patients suffering from Alzheimer’s disease (AD) and healthy controls using assessment of free fatty acid profiles results obtained with GC/MS and subsequent statistical analysis indicated that concentrations of five specific fatty acids varied between AD patients and those deemed healthy. Data analyses indicated drastically lower FFA levels in affected patients; with the most change observed with DHA. The results of this analysis demonstrate that FFA can be used to diagnose and determine the degree of disease progression in patients with AD. It was reported that fatty acids in urine were utilized as potential biomarkers for type 2 diabetes mellitus. The following fatty acids demonstrated the greatest utility as biomarkers: C16:0, C18:0, C18:2n- 6, C20:5n-3, C22:6n-3 [82]. Fatty acid profiles of patients’ urine samples were analyzed by UPLC/Q-TOF-MS. Recent developments focused on the urine metabolic profile, as sample collection was simple, non-evasive, and directly reflected the metabolic status of patients. Fatty acid biomarkers were used to distinguish between patients exhibiting pathology and those that were healthy.

總結

脂肪酸被認為是一種強大的信號化合物，參與許多代謝過程。脂肪酸的定量測定和脂肪酸譜的探索已成為脂質分析的必要條件。氣相色譜法和質譜法是分析複雜樣品中脂肪酸的有力手段。這允許選擇性地檢測幾種脂肪酸(小鏈、中鏈、長鏈和極長鏈)，以及它們的反同分異構體具有很高的靈敏度。本文綜述了幾種生物基質中遊離脂肪酸和複合脂類脂肪酸組成的分析方法。我們的研究範圍包括提取、純化、檢測，最後是定量。分析方法側重於GC/MS分析，包括最新的提取和衍生化協議，以及最新的檢測技術。所概述的程序提供了不同鏈長飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸之間以及異構體之間的基線分離。此外，我們還對其他基於脂質的信號分子進行了研究，如磷脂和甘油三酯。

此外，我們比較了脂肪酸衍生化的不同方案，這些方案得到了優化，以達到可接受的定量結果，可用於臨床診斷目的。一般來說，酯交換法，無論酸性或堿性條件，都適用於測試樣品的酯化。最近的方法，特別是在不建議去除衍生試劑的情況下，應更頻繁地評估其對氣相色譜柱效率的長期影響。需要優化光譜儀條件，以獲得廣泛的檢測能力和靈敏度，能夠測量複雜生物樣品中的微量脂肪酸。

確認

這項工作得到了馬裏蘭大學係統(2016年Wilson H. Elkins教授獎)的支持。作者也感謝科平州立大學和曼哈頓維爾學院的行政支持。內容完全是作者的責任，並不一定代表資助機構的官方觀點。

的利益衝突

作者對這項工作做出了同等的貢獻，應該被視為共同第一作者。作者聲明沒有利益衝突。

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文章類型:評論文章

引用:Johnston MR, Sobhi HF (2017) GC/MS方法用於臨床調查和診斷的脂肪酸分析進展。生物化學分析研究3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.111

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出版的曆史:

  • 收到日期:2017年11月09

  • 接受日期:2017年12月12日

  • 發表日期:2017年12月21日