摘要

目的:研究TLR4 Asp299Gly和MICA外顯子5微衛星多態性與坦桑尼亞撒哈拉以南非洲村民沙眼嚴重程度的關係。

方法:采用限製性片段長度多態性(RFLP)和基因掃描技術對MICA外顯子5微衛星和TLR4 299 A/G多態性進行基因分型^®,分別。研究了TLR4 Asp299Gly和MICA外顯子5微衛星與炎性沙眼(TI)和倒睫(TI)的相關性。

結果:結果顯示TLR4和MICA多態性與沙眼疾病嚴重程度以及保護之間存在關聯。TLR4等位基因與炎症性沙眼顯著相關(p=0.0410)，而G等位基因(p=0.0410)與保護相關。

結論:TLR4和MICA可能通過調節對Ct的免疫反應來調節沙眼疾病的嚴重程度。除了;對照中MICA-A9雜合子頻率的增加可能表明這些等位基因在適應Ct流行環境時的積極選擇。

關鍵字

沙眼;沙眼衣原體;炎症;倒睫;單核苷酸多態性;Toll樣受體4;微衛星多態性;主要組織相容性複合體(MHC) I類鏈相關基因A;雲母

核心提示

Toll樣受體4 (TLR4)和主要組織相容性複合體(MHC) I類鏈相關基因(MICA)的遺傳多態性可能與宿主對沙眼病的免疫及其亞臨床表型有關。由於MICA和TLR4等位基因在個體之間存在差異，並可能賦予不同的疾病易感性，因此了解MICA和TLR4等位基因在宿主炎症反應中發揮的重要作用，有助於炎症性疾病的研究。數據表明攜帶MICA-A9和Asp299Gly TLR4 G等位基因的坦桑尼亞人患沙眼病的風險較低。

簡介

沙眼病的特點是反複發作革蘭氏陰性沙眼衣原體(Ct)感染。感染引起慢性炎症和免疫纖維化過程，導致結膜瘢痕和致盲尖叫[1]。全世界約有8400萬人患有活動性感染;估計有120萬人視力受損，3%失明[2,3]。眼部疾病的發展分為五個階段，這些階段可能隨著嚴重程度的增加而重疊。這些階段包括沙眼性炎症，濾泡性(TF)，沙眼性炎症，強烈(TI)，沙眼性瘢痕(TS)，沙眼性倒睫(TT)和角膜混濁(CO)。根據這種分類，前兩個等級TF和TI代表急性感染，而其他三個等級代表疾病的慢性階段[4,5]。

炎症延長可導致TS和TT。雖然許多人感染了Ct，但隻有3%的人會出現致盲尖叫。此外，大多數感染是無症狀的，有證據表明，在感染自行消除後，疾病可能會持續數周。這可能提示宿主遺傳因素可能在調節對Ct的炎症反應中發揮重要作用，從而確定沙眼疾病的發病機製。細菌感染免疫應答的候選基因是研究其遺傳多態性及其與Ct發病機製關係的理想靶點。

主要組織相容性複合體(MHC) I類鏈相關基因A (MICA)作為配體激活殺傷細胞c型凝集素樣受體，亞家族D (NKG2D)(自然殺傷組2，成員D)受體表達在所有CD8 αβT細胞，γδT細胞和大多數NK細胞[7]表麵。在正常情況下，MICA分子的表達僅限於腸和胸腺上皮[8]。當MICA通過激活NKG2D被激活時，後者作為細胞窘迫的信號傳感器，並觸發一係列免疫效應機製，包括細胞毒性、細胞因子分泌和細胞增殖[9]。迄今為止，歐洲生物信息學研究所已經鑒定出101個公認的人類MICA等位基因和41個不同的MICB等位基因[10,11]。MICA基因外顯子5的微衛星多態性由8個基於GCT/AGC三聯體重複單元數量的等位基因(等位基因A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10)和一個額外核苷酸G/C插入(等位基因A5.1)組成[12-14]。MICA的微衛星多態性已被證明與免疫介導的疾病有關，如慢性係統性炎症性疾病白塞氏病[15]。

toll樣受體4 (TLR4)是脂多糖(LPS)的模式識別受體[16,17]，已被證明可誘導炎症反應相關基因的表達[18,19]。感染Ct後，細菌LPS被LPS結合蛋白(LBP)結合，並轉移到由CD14、TLR4和連接分子MD2組成的受體複合體。該複合物將啟動信號轉導級聯，導致通過轉錄因子核因子(NFκB)[20]釋放促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子α (TNF-α)。據報道，TLR4中的幾個單核苷酸多態性(SNPs)通過降低對LPS[21]的親和力來調節對LPS的反應。上皮細胞對Ct LPS的反應與NF-κB的核轉位有關，這表明信號通過與TLR4和CD14相互作用而發生，導致促炎細胞因子[22]的釋放。在人類TLR4基因[23]中已經鑒定出29個snp。其中，Asp299Gly (rs4986790)多態性已被證明可導致人肺泡巨噬細胞和氣道上皮細胞[24]對LPS的低反應性。攜帶Asp299Gly TLR4等位基因的個體具有較低水平的促炎細胞因子、急性期反應物和可溶性粘附分子，如白介素6和纖維蛋白原[25]。

鑒於炎症和先天免疫與沙眼感染的發病機製密切相關，並且TLR4和MICA的遺傳變異影響先天免疫反應，本研究的目的是確定TLR4 Asp299Gly和MICA微衛星多態性是否與坦桑尼亞人群沙眼疾病的易感性和嚴重程度有關。

材料與方法

根據《赫爾辛基宣言》，1996年進行免疫遺傳學研究時獲得知情同意，並得到約翰霍普金斯大學機構審查委員會的批準。本研究中的樣本是根據約翰霍普金斯大學批準的用於坦桑尼亞沙眼患者免疫原性研究的IRB方案收集的。我們之前發布了這些樣本[26]的第一組數據。所有被招募的成年患者都提供了書麵同意書，而未成年患者則由父母或監護人代表他們簽字。

研究參與者

本研究分為兩組研究對象。第一個是倒睫研究小組(TSG)，其研究對象是從1989年開始的一項關於女性瘢痕和倒睫發展的縱向研究(n=4932)中挑選出來的。1996年，從坦桑尼亞Dodoma地區Kongwa區11個村莊的16歲及以上婦女和女孩的人口樣本中隨機選取了186名感染婦女和186名未感染婦女。1999年隨訪時，74名受試者感染，85名未感染;73%的受試者在1996年和1999年感染了相同的ompA genovar衣原體。1996年，慢性感染患者更易出現倒睫、瘢痕和活動性沙眼[28,29]。總共有127份樣本，其中122份適合DNA分析。病例為倒睫±炎性沙眼(TI)的婦女和女童(n=21)，對照組為無或輕度疾病(無瘢痕性、非炎性濾泡性沙眼，伴或不伴感染[n=77])的婦女和女童。

在第二組，家庭沙眼研究(FTS)中，選擇了來自一個村莊的15個家庭，因為他們在1年期間的三個時間點持續感染了兒童(先驗者)(n=15)。經濟新聞基因分型數據表明，這可能是同一株[30]的持續感染或再次感染，表明無法產生保護性反應。這些孩子構成了案件。對照組是他們的父母(n=12)和兄弟姐妹(n=40)，他們的疾病很少或沒有(即父母中有兩個人有卵泡，但沒有對照組有炎症、疤痕或倒睫)。

采用簡化的世界衛生組織瞼結膜臨床分級方案對疾病進行分類，如下:無沙眼(TN)，≥5個至少0.5 mm的濾泡性沙眼(TF)，≥50%的正常瞼深層血管因上瞼結膜炎症增厚而模糊為炎性沙眼(TI±TF)，至少有1根睫毛接觸角膜或最近有證據顯示入眼睫毛被切除為翻睫症(TT)[31]。

衣原體DNA

先前發表並驗證的聚合酶鏈反應酶免疫分析法用於檢測MOMP-1基因的保守區域c . trachomatis溶解的跗骨結膜拭子[32]感染。本研究也描述了眼部樣本的采集和處理。每5個PCR樣本由現場采樣器插入PCR緩衝液的棉簽組成。汙染率為0.1%。

DNA提取

DNA的提取如先前出版物[26]所述。1999年在實地使用無菌尼龍細胞學刷(醫療包裝公司，加州Camarillo)從口腔黏膜中獲得DNA樣本。采用該方法是因為當時外周血單個核細胞難以獲得，且該方法已被證明適用於不同的遺傳分析方法。刷子在口腔表麵輕輕旋轉，然後放入單獨的信封，並釘在參與者的數據表和同意書上。樣品在多孔的包膜中幹燥，這有助於DNA的保存。將細胞學刷置於0.6 ml 50 mM NaOH和0.2 mM EDTA中，然後在80°C下孵育10分鍾，冷卻至25°C。然後輕輕攪動並取出刷子以釋放DNA。樣品用50µl的1 M Tris-Cl中和。為了更長的存儲時間，在裂解液中加入等量的90%甘油/水，並保存在-80°C。

為了消除任何懸浮蛋白和rna，所有DNA樣本都使用QIAamp (Qiagen Inc.， Valencia CA)進一步純化。簡單地說，400µl保存的裂解物被放置在含有20µl蛋白酶k的2 ml微離心管中，然後在56°C下孵育10分鍾，然後向樣品中添加400µl乙醇(96-100%)。將700 μ l前一步的混合物應用到QIAamp旋轉柱上，並以6000 × g (8000 rpm)的速度離心1分鍾。QIAamp旋轉柱放置在幹淨的2 ml收集管中，濾液安全丟棄。重複離心步驟後，向旋轉柱中加入500 μ l AW1 Buffer，以6000 × g (8000 rpm)離心1分鍾。使用AW2 Buffer重複此步驟。最後一步將QIAamp Spin Column置於幹淨的1.5 ml微量離心管中，加入150 μ l AE Buffer，室溫孵育1分鍾，然後以6000 × g (8000 rpm)離心1分鍾。純化的DNA保存於-20℃。

限製性片段長度多態性(RFLP)

TLR4Asp299Gly多態性在瓊脂糖凝膠上設計引物，通過大小區分正常等位基因和突變等位基因，篩選出多態性。步驟按照Lorenz et al.[33]進行。正向引物序列被改變，在小等位基因中產生一個限製位點。以下引物對用於TLR4 Asp299Gly，正向5 " - gattagcatacttagact ACTACCTCCATG-3 "和反向5 " - gatcaacttctgaaaaagcattcccac -3 "。前麵引物中下劃線的堿基表示核苷酸發生改變，形成了NcoI (TLR4Asp299Gly)限製性內切位點。使用Platinum Taq®PCR試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行反應。聚合酶鏈式反應(PCR)在33µl (20 - 60 ng的基因組DNA, 0.5 UTaqDNA聚合酶，引物各10 pmol, dNTP各10 mmol, MgCl 50 mmol₂．反應在96孔GeneAmp上進行^®PCR係統9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA USA)，使用以下條件:94°C 1分鍾，然後在95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒的條件下進行30個循環。將8微升所得PCR產物用限製性內切酶進行過夜消化，並使用4%瓊脂糖凝膠電泳係統(BMA, Rockland, ME, USA)分析TLR4等位基因。

雲母衛星

為了分析MICA基因TM區微衛星重複序列多態性，在[34]之前描述了以下引物:正向MICAF: 5 ' - ctttttttcagggaaagtgc -3 '和反向MICA5R:5 ' - CCTTACCATCTC- CAGAAACTGC-3 '。正向引物在5 '端用6-FAM標記(PE Biosystems, Foster City, CA)。PCR反應采用Ampli-Taq Gold進行^®PCR試劑盒(應用生物係統公司，福斯特城，CA，美國)。PCR在25µL(5µL 20 - 60 ng基因組DNA, 0.5 U Taq DNA聚合酶，每個引物10 pmol，每個dNTP 10 mmol, 25 mmol MgCl)的總體積中進行₂．反應被裝載在96孔GeneAmp上^®PCR係統9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA USA)，使用以下條件:94°C 2分鍾，然後30個循環，94°C 1分鍾，55°C 1分鍾，72°C 2分鍾。為了確定MICAgene TM區域的三組重複序列的數量，將1µl聚合PCR產物與10µl甲酰胺混合，並在95°C變性5分鍾。然後將樣品放置在冰上至少5分鍾，之後將它們裝入ABI PRISM 3100(應用生物係統公司，福斯特城，CA USA)。使用GeneScan分析ABI 3100生成的數據^®分析軟件。它的算法自動識別和大小每個峰相對於內部大小標準，以及提供峰麵積和峰高度的信息。導入Gene Scan軟件的結果，並使用Genotyper進行篩選^®提供最終結果的軟件，如等位基因調用和自動表構建。

統計分析

使用SAS/STAT®軟件9.1版(SAS Institute Inc.， Cary, NC)進行統計分析。對類別值采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，對連續變量采用Student t檢驗。通過卡方比較預期基因型頻率和觀察基因型頻率，計算對照受試者的Hardy Weinberg平衡(HWE)。對於每個SNP基因型，使用共顯性、顯性、隱性和對數加性遺傳模型進行測試。使用無條件邏輯回歸模型計算基因型95%置信區間的比值比(ORs)，以估計SNP存在對年齡沙眼風險控製的影響。雙側p值≤0.05為有統計學意義。分析中忽略了缺失值的參與者。使用統計分析包R(朗訊技術公司，默裏希爾，新澤西州)進行遺傳建模。

結果

與對照組(TN)相比，TI組(OR=0.63 95% CI: 0.4164-0.9532, p= 0.0520)和TT組(OR=0.53 95% CI: 0.3306-0.8496, p=0.0239) MICA-A9等位基因均有統計學意義(表1)。

表1:MICA微衛星等位基因與沙眼TI和TT臨床表型的關係

當MICA-A9基因型頻率分布與其他mica等位基因進行比較時，我們發現與對照組相比，MICA-A9基因型頻率分布與倒倒症(TT)的發生顯著相關(OR=2.324 95% CI: 1.187-4.548, p=0.016;表2)。此外，MICA-A9雜合子和純合子受試者的相對風險增加。結果顯示，TT患者MICA A9等位基因缺失時，其發病風險增加3倍(OR=1.549 95% CI: 1.104 ~ 2.017, p=0.016;(表2)，表明在人群中具有保護作用。

表2:沙眼X TI和TT臨床表型中MICA- A9微衛星基因型頻率:除A9外的等位基因。顯著p值(<0.05)

炎性沙眼組TLR4 A等位基因頻率顯著高於對照組(OR=0.160 95% CI: 0.029 ~ 0.870, p=0.0410)，對照組TLR4 A等位基因頻率顯著高於對照組(OR=6.350, 95% CI: 1.167 ~ 34.538, p=0.0410);TT患者和健康對照組之間等位基因和基因型頻率無顯著差異，而TI組TLR4 A/A顯著高於對照組，雜合度高於對照組(表4)。

表3:TLR4 Asp299Gly等位基因與坦桑尼亞沙眼的關係

表4:坦桑尼亞TLR4 Asp299Gly基因型與沙眼的關係

討論

本文提供的數據表明，人類MICA微衛星外顯子5和TLR4 Asp299Gly的基因組變異與人類病原體Ct感染引起的結膜炎症反應有關。致病環境是導致先天免疫係統基因基因組成變化的進化途徑的主要決定因素。TLR4和MICA的多態性就是這些變化的例子，並且與細菌感染的炎症反應生物學相關[35,36]。MICA與NKG2D相互作用，激活CD8+ T細胞、γ δ T細胞和NK細胞上表達的受體。已知MICA通過參與表達在NK細胞上的NKG2D來觸發NK細胞，並共同刺激一些γδT細胞和抗原特異性αβCD8+ T細胞。在αβCD8 T細胞中，NKG2D/MIC接合傳遞共刺激信號，補充tcr介導的靶細胞抗原識別。Allez et al.[37]提供證據表明MICA在克羅恩病和炎症性腸病患者分離的腸上皮細胞上表達顯著增加，提示MICA在應激上皮細胞炎症反應中的作用。Mei等人[38]研究了導致女性輸卵管性不孕症的MICA等位基因的多態胞外結構域與生殖器Ct的關係。這些數據表明，MICA位點可能改變宿主對Ct感染的炎症反應。在本研究中，MIC-A9等位基因在健康受試者中更常見，這表明其具有保護作用。 Mok et al. [39] reported on a possible protective role of MICA-A9 in the susceptibility to rheumatoid Arthritis in Korean subjects. Also, It has previously been reported that the MICA-A9 allele might confer protection from IDDM and celiac disease in the Spanish population [40,41]. This indicates that cells expressing MICA-A9 molecules might be properly recognized by γδ T cells, CD8+αβ T and NK cells, all of which are likely to have a role in overcoming Chlamydial infection and subsequently resolving Trachoma disease.

在不同人群中，編碼TLR4胞外結構域結構修飾的多態性[24,42]與細菌感染的顯著相關性[43-45]為這一關鍵先天免疫信號分子在應對革蘭氏陰性細菌感染中的作用提供了令人信服的證據。在我們的研究中，TLR4 G等位基因被發現具有保護作用(p=0.0410)，而A等位基因在TI表型中具有易感性(p=0.0404和0.0410)。預測建模研究[24,46]表明，該SNP位於TLR4蛋白的結合域，SNP的遺傳會引起構象變化，可能會改變TLR4與其他分子(如MD2)的相互作用，而這是信號傳導所必需的。與A/A純合基因型相比，TLR4 A/G基因型對炎症性沙眼具有保護作用。在本研究中，坦桑尼亞人群中MICA-A9雜合子相對較高，隨著健康對照組MICA-A9基因型雜合子和純合子率的降低，風險增加。雜合子優勢[47]理論常用於解釋自然群體中發現的遺傳變異，這可能解釋了MICA-A9雜合度的保護作用。我們的結果表明，MICA-A9和TLR4 Asp299Gly雜合性可能在沙眼流行的坦桑尼亞人群中具有選擇優勢。

總之，我們的研究結果表明MICA和TLR4可能與宿主對沙眼病及其亞臨床表型的免疫有關。由於MICA和TLR4等位基因在個體之間存在差異，並可能賦予不同的疾病易感性，因此了解MICA和TLR4等位基因在宿主炎症反應中發揮的重要作用，有助於炎症性疾病的研究。我們的研究結果表明，攜帶mica - a9和Asp299Gly TLR4 G等位基因的坦桑尼亞人患沙眼病的風險較低。進一步研究這些多態性與沙眼Ct感染炎症反應調控活性機製的結構功能關係。

作者的貢獻

MA:寫論文，做實驗。

MK、AR、VA、PF-H、HB進行數據分析。

GD, NB, TQ設計了本研究。

由

美國國立衛生研究院/國家過敏和傳染病研究所撥款RR03048;美國國立衛生研究院/國家研究資源中心撥款2G12RR003048;以及華盛頓特區霍華德大學的非洲僑民國家人類基因組中心。

院校檢討委員會聲明

這項研究得到了約翰霍普金斯大學機構審查委員會的批準。

知情同意聲明

1996年，根據《赫爾辛基宣言》，免疫遺傳學研究獲得了知情同意。

致謝

作者感謝Harran Mkocha和Kongwa沙眼項目的實地組成部分，Virginia Turner和Sidney Katala彙集了最初的女性倒錐病隊列，也非常感謝Gaurav Tripathi和Abubaker Sidahmed對手稿的評論。

利益衝突

沒什麼可透露的

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條信息

文章類型:研究文章

引用:王曉明，王曉明，王曉明，等。(2016)坦桑尼亞沙眼患者TLR4和MICA基因多態性與沙眼疾病嚴重程度的相關性研究。Autoimmun Infec Dis 2(3): doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-1025.116

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出版的曆史:

收到日期:2016年5月3日

接受日期:2016年5月25日

發表日期:2016年6月3日