摘要

背景

尋常型天皰瘡是一種自身免疫性水泡疾病，累及皮膚和粘膜。抗原靶點是橋粒蛋白，一種在橋粒中發現的鈣粘蛋白型細胞間粘附分子。免疫球蛋白G抗纖凝蛋白3抗體水平與疾病活動性呈正相關。此外，免疫球蛋白G4同型似乎在發病機製中起著主要作用。然而，抗纖凝素3抗體存在於臨床緩解期的尋常型天皰瘡患者。我們的目的是測量和比較臨床緩解期尋常型天皰瘡患者與臨床活動性天皰瘡患者的免疫球蛋白G4對纖凝素3的反應。

方法

我們納入了年齡在35-76歲之間的7名男性和10名女性白種人患者的血清。研究既往診斷為尋常型天皰瘡的患者(12例臨床活動性疾病，14例臨床緩解)，經酶聯免疫吸附試驗抗纖凝蛋白3自身抗體陽性。采用改良的酶聯免疫吸附法檢測抗纖凝蛋白3(總免疫球蛋白G、免疫球蛋白G1和免疫球蛋白G4亞類)抗體。同時，用間接免疫熒光法檢測抗皮膚抗體的免疫球蛋白G亞類。

結果

抗纖凝蛋白3特異性免疫球蛋白G1和免疫球蛋白G4亞類研究顯示，臨床非活動性疾病患者血清抗纖凝蛋白3免疫球蛋白G4亞類抗體水平低於活動性疾病患者血清(p=0.03)。但兩組免疫球蛋白G1水平差異無統計學意義。同樣，兩組間間接免疫熒光檢測的免疫球蛋白G亞類抗皮膚抗體的存在無統計學差異。

結論

抗纖裂蛋白3免疫球蛋白G4亞類自身抗體的水平看起來非常足以比較緩解期患者與臨床活躍的尋常型天皰瘡患者(p=0.03)。

關鍵字

尋常天皰瘡;Desmoglein;免疫球蛋白G;Anti-skin抗體;酶聯免疫吸附法;間接免疫熒光法;臨床緩解期;自身抗體

簡介

尋常型天皰瘡(PV)是一種自身免疫性疾病，可引起皮膚和粘膜起泡。天皰瘡的自身免疫靶點是橋粒蛋白，一種鈣粘蛋白型細胞間粘附分子，存在於橋粒中[1,2]。在形成[1]的分層鱗狀上皮中發現了纖裂蛋白1 (Dsg1)和纖裂蛋白3 (Dsg3)同型。針對Dsg1和Dsg3的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的發展導致了天皰瘡分類的進展[3,4]。PV患者存在抗dsg3和抗dsg1 IgG抗體，部分患者僅存在抗dsg3 IgG抗體[5-7]。

除了根據抗體譜鑒定天皰瘡亞型外，纖凝素抗體的定量與該病的臨床活動呈正相關。在PV患者中，通過ELISA定量Dsg3抗體與疾病的臨床活動相一致[6,8]。一些研究表明，IgG亞類在PV發病機製中的參與是非常不同的，其中IgG4具有主要作用。不同的IgG亞類具有不同的功能特性，從而可能決定IgG抗體的致病潛力[3,9-11]。在活躍的PV中，針對Dsg3的IgG4自身抗體占主導地位。IgG4反應對於臨床疾病的發展是必要的。在此基礎上，補體激活對於水泡的形成不是必需的。此外，血清IgG4的總量已被證明在天皰瘡[12]中增加。

這些數據表明，igg4靶向治療天皰瘡可能會產生有益的效果。靜脈注射免疫球蛋白治療降低IgG4抗dsg3抗體的水平，這種效果與改善臨床活性[13]相關。此外，在天皰瘡和其他疾病中使用B淋巴細胞耗盡療法獲得的良好結果與血清IgG4或Dsg3自身抗體水平降低有關[14,15]。

盡管IgG4抗dsg3自身抗體的水平與患者PV的臨床活性相關，但在臨床緩解的患者中發現了抗dsg3自身抗體的存在[6,11]。這些數據使這些測定方法在評估疾病活動性方麵的有效性受到質疑。此外，這些自身抗體在臨床緩解期間的意義是一個討論的問題。

該研究的目的是評估兩組患者抗dsg3抗體的IgG亞類組成，臨床緩解患者與臨床活動性疾病患者進行比較。ELISA檢測兩組患者IgG1、IgG4抗dsg3抗體水平。臨床緩解期PV患者血清中IgG4抗dsg3抗體水平低於臨床活動性疾病患者血清(p=0.03)。我們還將這些數據與抗皮膚抗體(ASA)的IgG亞類組成進行了間接免疫熒光(IIF)比較。

材料與方法

人類血清

我們收集了7名男性和10名女性白種人患者的血清，這些患者年齡在35-76歲之間，之前通過臨床表現、組織學和血清學測試陽性診斷為PV。我們選擇了26份抗dsg3自身抗體ELISA陽性的血清樣本。該項目是在納瓦拉大學倫理研究委員會的批準下完成的(nº79/2010)。

血清根據每個患者疾病的活動性分為兩組(補充信息)。第一組包括在臨床活動情況下采集的12個血清樣本，其特征是在任何治療前皮膚和/或粘膜上存在幾個活動病變。第二組包括臨床緩解期收集的14份血清樣本，臨床緩解期定義為皮膚和/或粘膜上沒有活動性病變，而患者接受低劑量(每天小於15 mg)皮質類固醇治療作為維持治療。

第二組患者接受的治療如下:高劑量(每天超過15 mg)皮質類固醇(P1、P6、P8、P9、P13和P14患者)、利妥昔單抗，每周靜脈注射4次，每次375 mg/m2 (P4、P5、P12、P15和P16患者)，或靜脈注射環磷酰胺脈衝治療(P2患者，7次，每劑量1000 mg;P7, 3劑，每劑1700 mg;P10，每劑1200mg, 10劑)。

為建立ELISA檢測抗dsg3 IgG1和IgG4亞類的截斷值，選取健康人群20份血清作為對照。所有血清保存在−20°C。

酶聯免疫吸附法檢測Dsg3抗體

根據製造商的說明，使用商用Dsg3 ELISA試劑盒(Euroimmun, Luebeck, Germany)定量Dsg3總IgG自身抗體。使用相同的商業Dsg3 ELISA試劑盒(Euroimmun, Luebeck，德國)定量抗Dsg3 IgG1和IgG4亞類，除了使用與辣根過氧化物酶偶聯的小鼠抗人IgG1或IgG4 (Beckman Coulter Inc, Fullerton, California)作為二抗

血清樣本從1:100開始連續稀釋。在波長為450 nm的光密度(OD)範圍內測定的最低稀釋度被確定為最佳血清稀釋度。每種血清的OD值通過將最佳血清稀釋倍數乘以稀釋係數來計算。偶聯物IgG1稀釋1:1000，偶聯物IgG4稀釋1:300。所有稀釋均使用商用Dsg3 ELISA試劑盒(Euroimmun, Luebeck, Germany)中提供的樣品緩衝液進行。

當IgG ELISA大於或等於製造商(Euroimmun, Luebeck, Germany)推薦的臨界值20相對單位(RU)/mL時，檢測值被認為是陽性。在450 nm波長下，抗dsg3 IgG亞類的截斷值為IgG1為0.643 OD, IgG4為0.237 OD。這些截斷點是根據20份對照血清樣本的數值分析確定的。截斷值等於對照值的平均值加2個標準差(SD)。

間接免疫熒光法

通過標準IIF檢測猴子食管底物的抗皮膚抗體(A. Menarini Diagnostics, Florence, Italy)。采用的染色程序如下:連續的血清稀釋(從1/10到1/640)應用於切片30分鍾(min)。用磁性攪拌器將載玻片在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌10分鍾，然後用二抗孵育30分鍾。最後清洗10分鍾，包括安裝介質。靈長類抗人IgG fitc偶聯物(Inova Diagnostics Inc, San Diego, California)被用作ASA分析的二抗。對於IgG亞類染色，使用小鼠抗人IgG1或小鼠抗人IgG4 fitc偶聯單克隆抗體(Beckman Coulter Inc, Fullerton, California)作為二抗。

統計分析

采用IBM SPSS Statistics v20軟件進行統計分析。用Shapiro-Wilk檢驗分析數據集的正態性。基於這些結果，我們進行了非參數(MannWhitney U)檢驗來比較變量。采用Spearman秩相關係數研究了兩者之間的線性關係。在所有情況下，p值<0.05被認為是顯著的。

結果

ELISA法測定抗dsg3抗體

臨床活躍性PV患者血清中IgG抗dsg3值(中位數=254.5 RU/mL)高於臨床非活躍性PV患者血清(中位數=178.0 RU/mL) (U MannWhitney檢驗p=0.04，表1)。兩組間IgG4抗dsg3抗體水平也有差異。臨床活動期患者的IgG1值(中位數=2.28 OD)高於臨床緩解期患者(中位數=0.68 OD) (U Mann-Whitney檢驗，p=0.03，表1)。但兩組間IgG1水平差異無統計學意義(中位數分別為0.75 OD和0.71 OD)。綜上所述，來自臨床活動性PV患者的血清樣本的總IgG和IgG4亞類抗dsg3值低於臨床活動性PV患者的血清(圖1)。

圖1:ELISA法測定臨床活動性尋常型天皰瘡患者和臨床緩解患者血清中抗纖凝蛋白3抗體(antiDsg3)我們測量了總IgG (A)和子類IgG1 (B)和IgG4 (C)。數據用箱形圖顯示。水平線表示在450nm處測量的相對單位(RU)/mL或光密度(OD)的中值。

IIF法檢測ASA抗體總IgG及亞類

我們分析了IIF數據，以檢測IgG, IgG1和IgG4 ASA。尋常型天皰瘡的典型熒光模式血清稀釋(猴子食管細胞間隙染色)被確定為陽性。我們比較了臨床緩解期患者與臨床活動期患者的數據(圖2)。臨床緩解期患者與臨床活動期患者之間沒有統計學上的顯著差異。隻有asa特異性IgG4有顯著性(U Mann-Whitney檢驗p=0.05，表1)。

圖2:臨床活動性尋常型天皰瘡患者和臨床緩解患者血清中抗皮膚抗體(ASA)的IIF測定我們測量了總IgG (A)和子類IgG1 (B)和IgG4 (C)。數據用箱形圖顯示。水平線表示滴度的中位數。

縮寫:ASA:抗皮膚抗體;Dsg3: Desmoglein 3;ELISA:酶聯免疫吸附試驗;IIF:間接免疫熒光;NS:無顯著性;OD:光密度;RU/mL:每毫升的相對單位

表1:尋常型天皰瘡患者抗凝血蛋白3和抗皮膚抗體的研究

改良ELISA與常規IIF的相關性

IIF和ELISA數據顯示出很好的相關性。IgG1、IgG4抗dsg3抗體與ASA IgG1、IgG4抗體均呈正相關(IgG1、IgG4抗體R分別為0.74、0.75)。

討論

我們用ELISA方法比較了臨床緩解期PV患者血清中IgG1和IgG4抗dsg3抗體的水平與活動性疾病患者的水平。我們還通過IIF研究了兩組患者ASA中IgG亞類的分布情況。在臨床緩解患者中，ELISA檢測到的antiDsg3 IgG4亞類抗體水平較低，這區分了臨床活躍的PV患者與非活躍的PV患者。IIF檢測到的ASA IgG亞類在兩組間差異無統計學意義。

自從ELISA檢測到Dsg3抗體後，患者的臨床評估變得更加容易，因為這些數據與疾病的臨床活動相關[8,17,18]。目前有幾種治療方法用於治療PV，包括靜脈注射免疫球蛋白或B淋巴細胞衰竭，這些方法由於對抗dsg3自身抗體水平的影響而取得了成功[13-15]。此外，IgG亞類之間的區分有助於更好地了解本病的發病機製[3,9]。IgG4被認為是導致PV[19]組織損傷的IgG亞類。

然而，已有大量天皰瘡患者在臨床緩解期出現抗dsg 3抗體反複報道[6,11,16,20,21]。這些觀察結果提出了關於Dsg3抗體測量在臨床活性評估中的價值的有趣問題。這些自身抗體在臨床緩解期間的作用尚不清楚，盡管提出了幾種可能性。一是在緩解期殘留在循環中的自身抗體主要是非致病的，而不是致病的[16,22]。另一種解釋是，使用的免疫抑製治療導致疾病的症狀抑製，但也不足以完全阻斷自身抗體反應[16]。

臨床緩解患者中抗dsg3抗體的存在，以及所描述的抗dsg3 IgG4亞類抗體的致病作用，使我們測試臨床緩解的PV患者與臨床活躍的患者中抗dsg3 IgG4亞類抗體的水平是否不同。我們發現，在臨床緩解期間，抗dsg 3抗體的水平低於先前報道的活動性疾病期間的水平。在這份報告中，作者聲稱，定期監測臨床緩解期PV患者的這些自身抗體水平可能有助於評估疾病活動性。我們的研究提供了新的信息，表明在臨床緩解期間，PV患者的IgG4抗dsg3抗體水平也較低。在一組臨床緩解的異質PV患者(包括抗dsg3陰性患者)中，Dhandha等人表明不存在亞類切換，這些患者的IgG4和IgG1均保持高水平。我們發現，在臨床緩解的患者中，IgG4抗dsg3的水平較低，但與臨床活動性疾病患者相比，緩解患者的IgG1水平沒有變化。可能這些差異的發生是因為我們的患者在臨床緩解期間Dsg3抗體的陽性更加一致。

這些發現具有特別的相關性，因為IgG4抗體在不同病理條件下的致病作用是眾所周知的。在PV患者中，IgG4抗體在水泡形成中的決定性作用已被證實[9,10]。另一方麵，新的治療措施對PV臨床疾病活動性的有益影響與IgG4自身抗體水平相關。靜脈注射免疫球蛋白可改善PV症狀，誘導抗dsg3 IgG4亞類抗體[13]減少。此外，B淋巴細胞耗盡療法，如抗cd20單克隆抗體，在PV患者中產生臨床獲益，與抗dsg3抗體[15]減少有關。

有趣的是，抗cd20治療在IgG4相關病理中的作用與血清IgG4水平[14]的降低有關。我們的數據顯示，IgG4抗dsg3自身抗體在臨床活性低的患者中減少，這有助於更好地理解這些發現。根據有無臨床疾病活動，在PV患者之間觀察到IIF數據無統計學意義上的差異。隻有ASA-IgG4亞類滴度有顯著性差異(p=0.05)。這可能是由於相對於ELISA的敏感性較低，以及兩種測定方法的不同特征。

當抗體水平與PV的臨床活動程度相關時，IgG4抗dsg3自身抗體的測量似乎是一個很好的標記。此外，生物學參數的使用，如檢測IgG 4抗dsg 3，看起來非常適合解釋給定的新治療對PV患者的療效。此外，在沒有臨床活性的情況下，這些抗體存在的致病意義值得進一步研究。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:José Antonio Delgado García, Carmen Pérez Robles, Juan José Mata Molanes, Laura Moreno Narro, Paula Arana Berganza(2015)尋常型天皰瘡患者IgG4抗desmoglin 3抗體水平與疾病活性相關。Autoimmun Infec Dis, Volume1.1: http://dx.doi.org/10.16966/2470-1025.101

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出版的曆史:

收到日期:2015年3月16日

接受日期:2015年4月14日

發表日期:2015年4月20日