摘要

山羊精液冷凍保存技術促進了羊群的生殖管理，並允許長時間保存精子的受精能力。然而，他們需要離心技術來去除精漿。這種離心可以機械地破壞精子膜，特別是如果它是在高重力和長時間進行。為了避免這種機械損傷，山羊精液的離心是用碘伏醇(坐墊®液)進行研究的，這種化合物起著“坐墊”的作用，避免了精子在離心管底部的強烈包裝。取自Murciano-Granadina山羊的精液樣品分為2個加碘伏醇和不加碘伏醇的試管，800 g離心20分鍾，取出上清液和棉被液，重懸於Thilmant培養基中，5℃冷藏24小時。之後，評價各類型樣本的運動質量、運動精子百分率、伊紅-黑rosine染色活力和形態異常百分率。在對結果進行統計分析後，我們得出，離心後的精子質量在兩種處理中都沒有顯著變化，但碘碘醇可以使山羊精液中的精子在離心後更完全、更不具有侵襲性的再懸浮和均質化，這將轉化為更大程度的未受損精子的恢複。

關鍵字

山羊;精子質量;冷凍精液;精液離心;Iodixanol

簡介

目前，冷凍和精液冷凍技術對於促進人工授精等輔助生殖過程是必要的，因為它們可以使精子的受精能力比新鮮精液保存得更久。當精液必須從采集地轉移到其他農場以傳播繁殖雄性的遺傳物質時，這種保護是必不可少的。它還有助於在活體動物被禁止或限製移動的情況下傳播遺傳物質，或在冷凍精液的情況下，它允許種質資源庫的存在，其中儲存了數千劑精液，有些甚至來自已經死亡的動物，這增加了遺傳多樣性和可用遺傳標本的數量。盡管精子冷凍保存有優勢，但我們不能忘記它需要一係列的操作指導方針，這些指導方針可能會影響精子質量和受精能力。在這些指導方針中，離心用於去除精漿，這被稱為精液灌洗。當使用含有蛋黃的稀釋劑時，必須清除精漿，因為在球尿道腺分泌的磷脂酶(存在於精漿中)之間發生相互作用，催化蛋黃中的脂類水解為脂肪酸和溶血磷脂，即使在很低的溫度下也對精子有毒[1,2]。因此，離心是消除這種毒性的一種方法，除了從射精中獲得更多的精子，以便隨後在冷凍介質中稀釋[3]。對於離心過程如何損害精子，目前還沒有完全被接受的解釋，但離心過程中可能發生的活性氧(ROS)過度形成對精子細胞的不利影響的假設[4,5]以及對精子膜[6]造成的直接機械損傷也被考慮在內。正是為了減輕這種對膜的機械損傷，研究人員用碘伏醇進行離心，碘伏醇是一種高分子量的膠體(非離子碘化合物)，可以保護精子免受高離心力造成的可能損傷。這種碘伏醇培養基比使用的精液和稀釋液密度大，因此沉澱在離心管底部作為“緩衝”; and would act to prevent sperm damage caused by being strongly packed against the hard surface of the tube bottom. This medium would provide a mattress effect to the sperm, which makes it deposit in a dense fluid, but without allowing it to reach the bottom of the tube. It is designed in equine semen to allow longer centrifugations at faster speeds, resulting in higher rates of recovery of undamaged sperm [7].

這項工作的目的是驗證在5°C冷藏24小時後，用碘伏醇離心的Murciano-Granadina山羊的精液質量與未使用該化合物離心的樣品是否存在差異。

材料與方法

為了進行這項研究，使用了5隻Murciano-Granadina (MG)品種的雄性。其中3人在試驗開始時為成年人(3至5歲)，另外2人是年輕男性(研究開始時為7至11個月)。成年男性和年輕男性之間的精液質量有很大差異，但這項工作感興趣的是用碘伏醇處理過的精液和不加碘伏醇處理過的精液質量之間的差異，而不是標本之間的差異。即便如此，研究人員還是考慮了不同樣品的初始質量，以評估碘克沙醇用於質量較差的樣品與用於質量較高的精液樣品是否會產生不同的效果。

用山羊人工陰道提取精液，用37℃回火的krebbs - ringer - phosphate稀釋劑[8]1 ml收集於玻璃管中。測量得到的純精液的體積，用相同的稀釋液稀釋到10毫升，以便能夠單獨看到精子。將20 μ l的稀釋劑滴在調至37°C的載玻片上，並在光學顯微鏡下以100倍放大觀察。確定個體運動性(個體運動質量，主觀評價從0到5，其中0對應所有不運動的精子，5對應非常快速的精子運動，表1)[9]，運動精子的百分比(主觀分配在微滴中移動的精子占總數的百分比)。精子濃度用分光光度計測定(SpermaCue^®)．將30µl的樣品和30µl的染色液混合，進行伊紅-黑rosine染色[10]，使我們能夠在400倍放大下了解在不同領域計數200個精子細胞後出現的活精子(它們是白色的，未染色)的百分比。用同樣的製備方法，我們在冷藏前測量每個樣品的形態異常百分率[10]。

描述性的價值	移動速度
0	沒有運動
1	尾部有輕微的波紋或振動，無進展
2	緩慢前進，包括停止和開始運動
3.	連續前進，速度適中
4	快速進步運動
5	非常快速的進步運動，細胞很難從視覺上跟上

表1:根據Cabodevilla和Catena 2012的個體運動分類。

將精液樣本冷卻至室溫(約23°C)。每個樣品被分為兩部分:5ml樣品沉積在一個空的玻璃管中，另外5ml樣品沉積在一個含有1ml碘伏醇的管中(緩衝^®流體)。以2200 rpm (800 g)離心20分鍾[11]。

將它們從離心機中取出後，首先吸入上清液，然後吸入碘伏醇，在不拖拽精子的情況下盡可能多地排出精子。

所得顆粒在5 ml Thilmant培養基[11]中重懸。

每個樣品的溫度在120分鍾內逐漸降低，直到達到5°C，在評估之前保持24小時的溫度。

對冷藏24小時的每個樣本的精液質量進行評估的方法與對新鮮和冷凍精液進行評估的方法相同，研究了相同的參數:個體運動質量、運動精子的百分比、使用伊紅-黑rosine染色的活力和形態異常。

結果

結果顯示為在3組中分別獲得的值的平均值:新鮮精液(F)，用碘伏伏醇離心的精液(I)和不用碘伏伏醇離心的精液(NI)。使用Statgraphics®centurion進行統計分析。我們使用方差分析表中的f檢驗分析了每個參數的平均值，以確定均數之間是否存在顯著差異。多重範圍測試確定了哪些均值與其他均值顯著不同，置信度為95%。

所使用的每個雄性的平均種子質量也顯示出來(表2)。

	年輕male1	年輕男性2	成年男性1	成年男性2	成年男性3名
射精量(ml)	0．5	0.7	1.3	2.5	1
精子總數(x106)	1110	3610	6781	8500	5533
個人能動性	3.	3.85	4.07	4.12	4.08
%流動精子	36	57	76.43	82.5	60
活染色(活百分比)	36	57.74	70	71	51
Morphoanomalies(%異常)	41.8	45.2	46.86	40.5	27.33

表2:每個男性的平均新鮮精液質量。

平均而言，這兩名年輕男性的精液質量比成年男性差，尤其是在精子濃度和個體活力方麵。成年雄性1和2的活動精子和存活精子的百分比高於其他雄性。

每個男性都得到了類似的結果，除年輕男性1和成年男性2的形態異常參數在碘克沙醇處理的樣本中表現出更高的異常形態百分比外，碘克沙醇處理的樣本的精子質量略高，但沒有顯著提高(p>0.05)。

為了消除每個樣本質量的個體效應，我們得到了每個評估參數的平均值，將所有雄性的值相加，而不單獨區分它們。結果如表3-7所示。

	年輕男性1		年輕男性2		成年男性1		成年男性2		成年男性3名
	我	倪	我	倪	我	倪	我	倪	我	倪
個人能動性	1.15	1	2.6	1.9	2.7	2.5	2.6	2．2	3．3	2.8
% mobilesperm	13	10	38	30.	37.1	36.4	50	45	40	40
活染色(活百分比)	17.8	13.1	44.3	44.6	62.4	62	61.6	60.4	45.1	43.7
形態異常(%異常)	33	29.2	24.8	25.8	36.4	46.1	30.5	28.7	23.7	25.7

表3:每個男性冷凍後的平均精液質量。

	n	平均	標準偏差	最低	最大
F	22	3、8一個	0, 61	2、0	4、5
我	22	2、4b	1, 34	0	3, 75
倪	22	2、1b	1、29日	0	3、5

表4:各組個體運動參數、標準差及最大值、最小值的平均值。
不同字母表示統計學差異(p≤0,05)

	n	平均	標準偏差	最低	最大
F	22	61年,1一個	19日,33	30日0	90年0
我	22	33、4b	20、20	0	60歲,0
倪	22	30日,7b	19日,54	0	50,0

表5:移動精子百分比的平均值在每個組中得到的評價標準差和最大值和最小值。
不同字母表示統計學差異(p≤0,05)

	n	平均	標準偏差	最低	最大
F	22	57歲的0一個	16日,93	22日5	86年0
我	22	45歲的7一個	25日,51	0	85年0
倪	22	44歲的3一個	26日,25	0	80年0

表6:各組活精子伊紅-黑rosine染色的平均百分率、標準差及最大值、最小值
不同字母表示統計學差異(p≤0,05)

	n	平均	標準偏差	最低	最大
F	22	41歲的6一個	12日,33	15日0	62年0
我	22	30日,7b	16日,88	7日0	68年0
倪	22	33歲的3a、b	17日,84年	8日0	84年0

表7:各組精子形態異常(異常形態)的平均百分比、標準差及最大值、最小值。
不同字母表示統計學差異(p≤0,05)

新鮮精液樣品與冷凍精液樣品在個體活力參數和運動精子百分比方麵差異顯著，而離心樣品與NI離心樣品差異不顯著。

可活精子百分比參數在3組間無顯著差異。

新鮮精液與碘伏醇離心精液的平均形態異常有顯著差異，新鮮精液的差異更大。

新鮮精液與無碘伏醇離心精液、離心和冷凍精液之間的差異不顯著。

在使用碘伏醇和不使用碘伏醇處理的精液中獲得的參數的平均值內，我們發現兩者之間沒有顯著差異，但在使用碘伏醇處理時它們略大。當觀察到最大值時也會發生同樣的情況，這總是有利於填充介質的處理，盡管這些差異在參數的平均值中並不顯著。

當觀察離心後得到的球團時，我們注意到在沒有碘伏醇的試管中，精子球團似乎強烈地粘附在離心管底部。這種顆粒在重懸浮介質中的均質化需要很強的機械處理，在大多數情況下，有精子細胞的積聚，沒有完全混合。另一方麵，在用碘伏醇離心的精餾液中，精子顆粒在管底的上清液和碘伏醇之間被觀察到一條白線，在這種情況下，它很容易在新介質中以均勻的方式重新懸浮，隻需要輕微的攪拌，不需要高機械力，也沒有肉眼可見的細胞積聚。

討論

離心處理精子樣品的主要問題之一是盡可能多地回收精子，同時對精子完整性的損害最小。在這項工作中，我們研究了與碘伏醇離心山羊精液相比，與沒有碘伏醇離心的相同精子樣品相比，山羊精液離心是否提高了精液的質量。我們最初的假設集中在碘伏醇可以緩衝精子細胞在離心過程中由於重力而遭受的機械損傷，因此相對於沒有它的離心樣品，碘伏醇可以提高精子細胞的生存能力。碘伏醇是一種傳統上用於細胞分割密度梯度的產品[12,13]，傳統上用於馬精液清洗，在恢複未受損精子數量方麵效果良好[14-16]。第一個報道在馬精子離心中使用碘伏醇的工作是由[17]。他們報告說，在600克離心15分鍾無碘伏醇的精液中，活精子/正常精子比在1000克離心25分鍾有碘伏醇[16]的精液少30% (P<0.05)。比較使用5 ml buffer - fluid®在1000 g離心20分鍾與不使用它在600 g離心10分鍾。他們在解凍後的進步性運動方麵沒有顯著差異，但使用填充離心技術時，精子回收率明顯更高。其他作者[16,18-20]也在馬精液中獲得了更高的精子回收率和更小的明顯精子損傷[21,22]，使用豬精液，發現使用碘克沙醇和不使用碘克沙醇離心的樣品的活力和功能沒有顯著差異，但使用該床墊離心的樣品離心後精子損失較低，結論是碘克沙醇離心提高了精子回收率而不影響精子質量。我們對山羊精液的研究結果顯示，離心後的I和NI樣品在評估的精液質量參數上沒有顯著差異(P>0.05)，但它們在所有平均水平上略微優越，特別是在活動精子的百分比上，與NI樣品相比有近3%的差異。 They gave lower viability results than other authors who worked with chilled goat semen [23,24], due to the low fresh seminal quality of the young males, which decreased the average number of viable spermatozoa. However, the aim of this study was to compare seminal washing with and without Iodixanol, and both in good quality semen and in semen with lower viability and motility rates and lower concentration, the differences in quality were not significant with or without treatment. Where we did find the greatest differences was in the resuspension of the sperm pellet in the incubation medium. The lack of adhesion to the tube in the samples treated with Iodixanol allowed resuspension to be carried out homogeneously and without the use of further mechanical forces such as pipetting, which was required to detach and homogenize the pellets from the samples centrifuged without Iodixanol. Even with the use of pipetting forces, more undissolved spermatozoa were left in NI samples than in I samples. This would mean that sperm recovery would be lower in NI samples, since spermatozoa adhering to the glass or forming clumps would not be recovered. This, together with allowing for higher centrifugation forces and times, as published by the abovementioned authors, would result in a higher number of undamaged recovered spermatozoa, since centrifugation with Iodixanol would avoid causing further mechanical damage to the sperm cells in order to achieve their resuspension.

結論

用碘伏醇離心羊精樣品不影響5°C冷凍保存的樣品的質量，但有助於促進精子在重懸浮介質中的均質化，這將導致未受損的恢複精子的數量增加。山羊精子回收率的提高需要在未來的研究中得到證實。

用碘伏醇處理不影響幼山羊或成年山羊的精子質量，無論動物的起始精子質量如何。

它也不依賴於離心前後精子的稀釋程度。

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條信息

文章類型:研究文章

引用:李誌強，李誌強，李誌強，李誌強(2020)羊精離心對山羊精液精子質量的影響。動物科學研究4(1):dx.doi.org/10.16966/2576-6457.135

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出版的曆史:

收到日期:2020年1月27日

接受日期:2020年2月24日

發表日期:2020年2月28日