文摘

基於小亞基的分子生態學技術(四)核糖體rna序列可能會提供一個完整的描述的瘤胃微生物。本研究描述了PCRSSCP V3地區16 s rRNA的分析作為一個潛在的目標描述瘤胃微生物利用宏基因組DNA。所有的數百份DNA樣本分離山羊瘤胃酒受到放大16 s rRNA基因的使用細菌通用引物。16 s rRNA放大使用V3地區的第一輪PCR產品模板。V3地區的六十三個樣本顯示陽性擴增。這些PCR SSCP篩查,發現11個不同的SSCP模式。五個代表性樣本了五個不同的SSCP模式是測序和序列分析。V3地區和係統發育樹的序列分析表明,V3地區被發現的DNA序列集群不同和發現與V3地區的SSCP概要文件。因此16 s rRNA的V3地區真正反映了瘤胃細菌社區。因此,建議PCR-SSCP V3地區作為替代研究瘤胃細菌多樣性及其識別的costintensive宏基因組的方法。

關鍵字

瘤胃微生物;PCR-SSCP;16 s rRNA;V3區;DNA指紋

介紹

瘤胃微生物對反芻動物生產至關重要。瘤胃微生物的功能原理是植物材料轉化為食品的牛奶和肉[1]。因此瘤胃被操縱,提高動物生產。操縱瘤胃微生物的全貌瘤胃微生物組是重要的,但它缺乏。無數的努力研究瘤胃微生物的遺傳多樣性和瘤胃的生態係統。直到最近,瘤胃微生物學的知識主要是獲得使用古典文化技術,如隔離、枚舉和營養特性占10 - 20%的瘤胃微生物種群。使用的方法是費力而耗時的。努力確定文化無關的研究描述了瘤胃微生物。這樣一個文化無關的研究可以通過訪問是微生物宏基因組分析微生物群落的集體基因組。新的基於DNA技術利用宏基因組DNA現在被用來檢查微生物多樣性主要通過使用小亞基rDNA分析和理解複雜的微生物生態係統的功能。 The 16S rRNA is universal in bacteria, the conserved region is common for all bacteria and the variable region is unique to particular bacterial genera or species.

單鏈構象多態性(SSCP)是一種電泳技術。nondenaturing條件下,單鏈dna折疊成二級結構(構象)根據其核苷酸序列及其物理化學環境。在nondenaturing條件下,單鏈DNA的折疊結構(ssDNA)是受分子內相互作用的影響。折疊ssDNA的電泳淌度,因此,受到這些順序相依的影響性質和分子的分子質量,允許PCR分離產品的大小相同,但是不同的序列由於不同流動性的折疊結構[2]。因此,該技術已成功應用於識別序列變化從不同生物的基因。

因此,變量的PCR擴增區域16 s rRNA的宏基因組DNA分離瘤胃結合單鏈構象多態性(SSCP)已經申請了瘤胃微生物群落的分析。

材料和方法

樣本收集和DNA提取

大約50毫升的瘤胃中收集的酒是光票托收瓶從100年山羊在Puducherry直轄市屠宰場屠宰。這是通過棉布轉移到去除顆粒物。濾液用於DNA提取。微生物總DNA提取的細胞裂解方法修改[3]。DNA的質量檢查1%瓊脂糖凝膠電泳和DNA產量評估使用分光光度計(A_260年/一個_280年)。

PCR擴增的16 s rRNA V3的地區

的引物用於細菌16 s rRNA基因的擴增和V3區16 s rRNA表1中給出。每個PCR進行總量的20µl反應混合物由10 pmol每個引物,2µg模板DNA和10µl 2 x PCR的主人。16 s rRNA的PCR擴增是由熱循環(Mastercycler EP,埃普多夫)使用計劃:最初的10分鍾在94℃變性,緊隨其後的是30個周期在94℃變性的60年代,60年代在50℃退火和延伸率在72℃,持續60秒,最終擴展在72℃5分鍾。第一輪PCR產品是用作第二輪PCR模板DNA針對16 s rRNA V3的地區。放大V3地區使用著陸方法執行由最初在94℃變性的4分鍾,15個周期在94℃變性1分鍾,在65℃退火1分鍾和擴展在72℃1分鍾的退火溫度降低了0.5℃/循環進行的循環和15個周期94℃1分鍾,55℃1分鍾和72℃1分鍾之後,最終72℃伸長4分鍾。PCR產品尺寸(193個基點)檢查在1%瓊脂糖凝膠。

底漆	引物序列 (5 '一個3 ')	目標	目標的大小	參考
27樓	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG	細菌通用引物16 s rRNA	1400個基點	萊恩DJ et al。[4]
1492 r	GGTTACCTTGTTACGAACTT
V3 F	CCTACGGGAGGCAGCAG	V3	193個基點	Muyzer等。[5]
V3 R	ATTACCGCGGCTGCTGG

表1:引物的細節。

單鏈構象多態性(SSCP)

變性加載緩衝區(10µl)包含95%的甲酰胺,10毫米氫氧化鈉和0.025%溴酚藍添加10µl PCR產品。混合物在94℃加熱10分鍾,在冰上冷卻10分鍾下來。SSCP分析進行了如下:12%的聚丙烯酰胺凝膠濃度,16厘米×18厘米×1毫米大小。這種凝膠受到跑前在250 V 30分鍾25℃使用0.5×此種緩衝區。變性樣本(20µl)加載到井。電泳是在250 V 3小時25℃使用0.5 x此種緩衝區。根據Bassam BJ的過程,等。[6],凝膠銀染和樂隊白光背景下可視化和記錄使用凝膠文檔(Bio-Rad)係統。

測序和序列分析

五個樣品與不同的SSCP模式受到re-amplification V3地區和PCR產品自定義排序(歐陸坊基因組學Pvt Ltd,班加羅爾)。

序列的相似性搜索是由爆炸。血統和分類法為每個序列生成報告從爆炸分析細菌的鑒定。係統發育樹構建使用MOLE-BLAST計劃。

結果與討論

了解瘤胃微生物群落的功能和組成有必要提高動物生產[7],降低甲烷排放[8]。傳統培養方法列舉瘤胃微生物被取而代之的是分子技術被用於描述複雜的瘤胃微生物群落及其交互。

核糖體基因的分子技術基於放大允許定量和定性研究瘤胃微生物種群。在原核生物中,全長的16 s rRNA(大約1500個基點)可用於分類識別[9]和細菌多樣性[10]。16 s rRNA序列由九個變異度高的地區(V1-V9),由九個高度保守的區域[11]。九個定義良好的高變區(V1 V9) 16 s rRNA的基因包含各種分類信息(12 - 14)。引物對針對V1 V3, V3to V5和V6 V9通常導致整體相似,但準確的分類與小偏差[13]。大部分的研究目標識別的V3地區細菌[15]。所以在這項研究中,16 s rRNA的V3地區被選為調查SSCP模式及其與細菌多樣性。PCR-SSCP分析允許更大範圍的微生物的檢測環境包括土壤[16],飲用水供應係統[17],和環境灰塵[18]。

100個樣本,共63個樣本顯示放大的V3地區在第二輪PCR。預期的產品尺寸檢查193個基點1%瓊脂糖凝膠電泳圖1所示。PCR擴增的DNA樣本(63)獲得通過一組引物為V3地區受到SSCP分析。Silver-stained聚丙烯酰胺凝膠顯示單鏈構象多態性模式。在六十三(63)樣本篩選,11(11)不同的SSCP檢測模式,其中,五模式是常見(箭頭標誌)(圖2)。

圖1:PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳V3地區巷1:100個基點DNA梯;巷2 - 9:PCR產物(193個基點)。

圖2:PCR SSCP模式放大16 s rRNA V3的地區

樣品(5)與最經常觀察SSCP V3地區模式選擇和放大。放大產品是測序和序列分析。這個序列分析導致識別序列相似性與細菌16 s rRNA 94%的程度。

文化無關16 s rRNA基因測序已經廣泛應用於檢查雞腸道中的微生物多樣性[19],人類腸道[20]和識別細菌病原體的臨床樣本[21]。

不同細菌物種之間的序列多樣性意味著16 s rrna基因序列已被廣泛用於係統發育研究和分類分類[22日10]。由於成本和時間管理,部分rrs基因序列通常是確定在大多數研究調查了各種微生物的多樣性和物種豐富度。V3的序列分析(23、24)地區的16 s rRNA瘤胃細菌多樣性的基因被用於分析。因此Sanger測序V3地區被用來描述山羊瘤胃細菌種群。

係統發育樹構建(MOLE-BLAST)基於V3區域的序列相似性表明序列的聚類屬於五個不同樣本不同(圖3)。PCR-SSCP概要文件獲得的差異被發現被關聯到一個不同序列支持V3的意義地區細菌多樣性的研究。高變的V3的16 s核糖體RNA基因是有針對性的,因為它包含的最大核苷酸異質性已被選為分析微生物群(25日- 27日)。

圖3:係統發育樹構建基於序列16 s rRNA V3的地區。所有五個序列測試集群不同。

基於爆炸分析、血統和分類生成報告。V3地區的血統和分類報告確定了屬普氏菌、Sphingobacterium Pedobacter,黃杆菌屬和未受教育的擬杆菌屬於門擬杆菌門。但V4-V5區域的序列分析確認門變形菌門包含屬Lysobacter、Aquimonas Pseudovibrio,Candidatus落後,無教養的Burkholderials門和擬杆菌門包含屬普氏菌、Sphingobacterium Croceibacter黃杆菌屬。生物識別基於V3區與先前的報告相一致。擬杆菌門是第二個最主要的門在山羊瘤胃[10]。屬普氏菌主要在瘤胃一般(28 - 30)報道,門擬杆菌明顯高於在年老的動物和幾乎完全由屬普氏菌。擬杆菌門菌綱的110天的舊組顯著高於90天的老山羊群表2 [1]。

S.No	樣品沒有	門	生物顯示序列相似性	函數
1	85年	擬杆菌門	黃杆菌屬、Sphingobacterium擬杆菌、Pedobacter Hymenobacter	纖維素和半纖維素降解
2	86年	擬杆菌門	普氏菌、擬杆菌	纖維降解、消化的大分子
3	92年	擬杆菌門	普氏菌、擬杆菌	纖維降解消化的大分子
4	94年	擬杆菌門	普氏菌,Sphingobacterium	纖維素降解。纖維降解
5	96年	擬杆菌門	普氏菌、擬杆菌	纖維降解。消化的大分子

表2:V3地區的生物識別基於序列相似性。

從上麵的,很明顯,V3的地區是一個更好的指標序列的細菌多樣性和真正反映了瘤胃細菌社區。PCR-SSCP可以降低所需的成本和時間序列的係統發育分析。因此,建議PCR-SSCP V3地區作為替代創建DNA指紋研究瘤胃細菌多樣性及其識別的cost-intensive宏基因組的方法。

的利益衝突

作者宣稱沒有利益衝突。

引用

1. 楊漢族人X, Y,燕H,王X,瞿L, et al .(2015)瘤胃細菌多樣性的80 - 110天的山羊使用16 s rRNA測序。《公共科學圖書館•綜合》10:e0117811。(Ref。]
2. 金澤Orita M, Iwahana H, H, Hayashi K,漫畫家關穀神奇T(1989)檢測多態性的人類DNA凝膠電泳單鏈構象多態性。86年《美國國家科學院刊年代:2766 - 2770。(Ref。]
3. 於Z,莫裏森M(2004)改進提取PCR-quality社區digesta DNA和糞便樣本。生物學技術36:808 - 812。(Ref。]
4. 萊恩DJ (1991) 16 s / 23 s rRNA測序。:Stackebrandt E,格拉漢姆·古德費勒米(eds)核酸技術在細菌的係統。約翰•威利和兒子,紐約,美國,115 - 175。(Ref。]
5. Muyzer G, de Waal EC、Uitterlinden AG)(1993)分析複雜的微生物種群通過變性梯度凝膠電泳分析聚合酶鏈reaction-amplified 16 s rRNA的基因編碼。:環境Microbiol 59: 695 - 700。(Ref。]
6. Bassam BJ, Gresshoff點(2007)銀染色DNA在聚丙烯酰胺凝膠。Nat Protoc 2: 2649 - 2654。(Ref。]
7. Nathani NM, Patel AK, Mootapally CS, Reddy B,沙SV, et al。(2015)粗糧對瘤胃微生物群組成的高效飼料轉換器和堅固的印度Jaffrabadi布法羅(Bubalus狷羚)。BMC基因組學16:1116。(Ref。]
8. 楊C,看上去是的,我自己,華萊士RJ硝酸(2016)和抑製瘤胃甲烷生成:微生物生態學、障礙,降低反芻動物甲烷排放量的牲畜的機會。前麵Microbiol 7: 132。(Ref。]
9. Rajendhran J, Gunasekaran P(2011)微生物發展史和多樣性:小亞基核糖體RNA序列分析。Microbiol Res 166: 99 - 110。(Ref。]
10. 金米,莫裏森M, Yu Z(2011)狀態的瘤胃微生物係統發育多樣性的人口普查。《生態76:49 - 63。(Ref。]
11. 王Y,錢PY(2009)保守片段細菌16 s rRNA基因和引物設計16 s核糖體DNA擴增子在宏基因組研究。《公共科學圖書館•綜合》4:e7401。(Ref。]
12. Helb Chakravorty年代,D, Burday M,康奈爾N, Alland D(2007)詳細分析16 S核糖體RNA基因片段的致病菌的診斷。69年J Microbiol方法:330 - 339。(Ref。]
13. 很C,董問(2012)評估RDP分類器精度使用16 s rRNA基因變量地區。宏基因組1:e235551。(Ref。]
14. 城堡PD, Jenior ML, Koumpouras CC,威斯克SL,漢蘭達SK(2016)使用16 s rRNA基因片段測序,PacBio SMRT DNA測序係統。PeerJ 4: e1869。(Ref。]
15. 你們NF,陸F,邵LM, Godon JJ,他PJ(2007)細菌群落動態和產品分布在pH-adjusted發酵蔬菜廢物。J: Microbiol 103: 1055 - 1065。(Ref。]
16. 止住血,我洗澡,克拉普JP,伯恩斯RG (2001) PCR-SSCP比較16 S rDNA多樣性土壤DNA序列獲得使用不同的分離和純化方法。《生態36:139 - 151。(Ref。]
17. 為S, R,命名Holtje C,韋氏比重P,水上旅館J, et al .(2006)的細菌群落組成和動態的飲用水供應係統評估的RNA, DNABased 16 S rRNA基因指紋。:環境Microbiol 72: 1858 - 1872。(Ref。]
18. Korthals M,針對喬丹,Tebbe CC, von Mutius E,鮑爾J(2008)應用PCR-SSCP分子流行病學研究農場的孩子接觸的細菌在環境灰塵。J Microbiol冰毒73:49-56。
19. 甘Shaufi MMA、Sieo CC Chong CW,嗯,何鴻燊YW(2015)破譯雞腸道微生物動力學基於產量很高16 s rRNA宏基因組分析。腸道Pathog 7: 4。(Ref。]
20. 沃克啊,馬丁JC,斯科特•P Parkhill J,弗林特HJ, et al。(2015) 16 s rRNA基於基因的分析人類嬰兒的腸道微生物群強烈影響樣品處理和PCR引物的選擇。微生物組3:26。(Ref。]
21. Srinivasan R, Karaoz U, Volegova M, MacKichan J, Kato-Maeda M, et al .(2015)使用16 s rRNA基因的識別範圍廣泛的臨床相關的細菌病原體。《公共科學圖書館•綜合》10:e0117617。(Ref。]
22. 小池百合子,Yoshitani年代,小林Y,田中K(2003)係統發育分析fiber-associated瘤胃細菌社區和PCR檢測無教養的細菌。《229:23-30。(Ref。]
23. 莫尼耶Sadet年代,馬丁C, B, Morgavi DP (2007) PCR-DGGE分析揭示了一個獨特的細菌種群的多樣性與瘤胃上皮細胞。動物1:939 - 944。(Ref。]
24. 巴斯哈,安德森CL,穆勒MJ, Kononoff PJ,費爾南多SC(2016)瘤胃細菌群落組成在荷斯坦和新澤西州牛相同的飲食條件下是不同的和不受采樣方法的影響。前麵Microbiol 7: 1206。(Ref。]
25. 針對SM, Dethlefsen L, Huber JA,馬克•韋爾奇D, Relman噠,et al .(2008)探索微生物多樣性和分類法使用半導體存儲器rRNA高變的標簽排序。公共科學圖書館麝貓4:e1000255。(Ref。]
26. 李W,漢族L, Yu P,馬C,吳X, et al。(2014)嵌套PCR-denaturing梯度凝膠電泳分析人類皮膚隨著年齡的微生物多樣性。Microbiol Res 169: 686 - 692。(Ref。]
27. 王H, Du P,李江,張Y,張W, et al。(2014)之間的微生物組比較分析準確識別16 s rDNA和量化細菌在模擬樣品。J地中海Microbiol 63: 433 - 440。(Ref。]
28. 史蒂文森DM,魏瑪PJ普氏菌(2007)的主導地位和低豐度的古典瘤胃細菌物種牛瘤胃揭示了相對定量實時PCR。生物科技:Microbiol》75: 165 - 174。(Ref。]
29. 貝克勒AZ,小池百合子,小林Y(2010)遺傳多樣性和飲食以普氏菌的特異性的揭示了16 S rRNA genebased分析。《305:49-57。(Ref。]
30. 傑米E,以色列,Kotser Mizrahi我(2013)探索牛瘤胃細菌社區從出生到成年。ISME J 7: 1069 - 1079。(Ref。]

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條信息

文章類型:研究文章

引用:Kiruthiga R, Thanislass J,安東尼PX,麗迪雅,烏瑪Maheswari D, et al。(2018) 16 s rRNA V3的SSCP分析地區的山羊瘤胃微生物的特性。J動畫Sci Res 2 (1): dx.doi.org/10.16966/2576 - 6457.110

版權:©2018 Kiruthiga R, et al。這是一個開放的文章下分布式知識共享歸屬許可條款,允許無限製的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被認為提供了原作者和來源。

出版的曆史:

收到日期:2017年9月22日,

接受日期:2018年1月10

發表日期:2018年1月17日