圖1:實時PCR的獨特IS900放大從兩個目標序列m . avium無性係種群。副結核參考菌株(答:寫明ATCC baa - 968;B: 43015 B),臨床地圖隔離(C和D)和E: non-MAP物種(m . fortuitum無性係種群。fortuitum M.intracellulare, m . kansasii m . marinum m . phlei和m . scrofulaceum)。
全文
Teshome Yehualaeshet1 *瑪莎·格雷厄姆2Temesgen撒母耳1莎拉·E羅莫頓3Soren Rodning4Tsegaye Habtemariam5
1 病理學,塔斯基吉大學獸醫學院分析塔斯基吉,阿拉巴馬州,美國2 醫藥科學,美世亞特蘭大大學校園,亞特蘭大,喬治亞州,美國
3 Thompson-Bishop-Sparks狀態診斷實驗室,赤褐色,阿拉巴馬州,美國
4 奧本大學動物科學係的赤褐色,阿拉巴馬州,美國
5 計算中心流行病學、生物信息學及風險,塔斯基吉大學獸醫學院分析塔斯基吉,阿拉巴馬州,美國
*通訊作者:Teshome Yehualaeshet,病理學,塔斯基吉大學獸醫學院美國電話:(334)727 - 8107;傳真:(334)724 - 4110;電子郵件:teyehual@mytu.tuskegee.edu
聚合酶鏈反應(PCR)已被用於改善識別鳥型分支杆菌無性係種群。副結核(地圖)。本研究的目的是比較和驗證實時PCR結果IS900-insertion序列和假定的9個序列診斷模板檢測地圖。地圖參考菌株、現場隔離,non-MAP物種被包括在研究來驗證目標基因的特異性PCR檢測。IS900插入序列和假定的序列都是專門從野外放大隔離和參考地圖的壓力而沒有發現放大六non-MAP菌株。Uniplex複合pcr IS900和假定的序列分別顯示兩個不同的擴增子的存在。此外,在網上PCR仿真表明,本研究中使用的引物對IS900序列和假定的序列僅從已知的地圖放大,對63種non-MAP不利。早期、準確和精確的診斷協議將協助追蹤汙染牛群,食品和最終導致慢性細菌性腸炎的預防控製。基於我們的結果在我們的樣本的大小,IS900插入序列和重複序列隻在地圖放大。插入/重複序列PCR目標不是non-MAP物種中發現的測試實驗。此外,在網上PCR擴增支持在活的有機體內PCR結果。
m . avium無性係種群。副結核;IS900插入序列;聚合酶鏈反應;假定的序列;檢測
慢性細菌性腸炎引起的鳥型分支杆菌亞種副結核(地圖),越來越被認為是一個重要的群體的健康問題;因此,需要一個可靠的診斷工具大規模使用促進預防和控製程序和最終根除疾病。地圖是一個極其緩慢,acidfast mycobactin-dependent病原體生長。這種細菌感染導致的慢性肉芽腫性腸炎廣泛的宿主主要是在牛和其他野生和家養反芻動物[1]。
MAP-infected動物的檢測帶來了很大的困難,因此直接檢測的快速和可靠的程序地圖群和食品樣品中仍具有挑戰性。一直努力在過去的幾十年裏開發協議檢測糞便的地圖,牛奶,組織,食品和環境樣品使用不同的方法。糞便文化和血清學是臨床最常用的測試實驗室[1]。慢性細菌性腸炎的黃金標準是識別病原體的地圖,在組織病理損傷[2]顯示特征。文化需要8到12周,在敏感性眾所周知的局限性,特別是在子臨床感染牛、周轉時間;盡管如此,文化或其他方法來檢測直接映射仍有一個地方在特定階段的慢性細菌性腸炎控製程序[3]。
隨著新的分子技術的發展,更強大的協議已經成為提高地圖的檢測。PCR是一種強大的方法來檢測特定的DNA序列,樣本可以從初乳,牛奶、糞便、和組織(4、5)。分子檢測的地圖,PCR分析針對不同地區特定的地圖從不同的實驗室報告。PCR目標基因包括映射為特定基因組序列,如插入序列IS900 F57元素,IS1311插入序列和hsp X基因[5 - 7]。其中,多拷貝IS900是目標的選擇和使用最廣泛的特征映射。IS900插入序列的特征,存在1451個堿基對,15到20冊的地圖基因組,使準確識別的最小數量的細菌DNA聚合酶鏈反應(PCR)測定[8]。此外,通過抑製減去hybridization-based方法,9個小說地圖的碎片從318年到596年,英國石油公司已確定和特點。一個數據庫搜索與其他顯示很少或沒有相似之處分枝杆菌物種[9]。
有必要驗證現有的協議和目標檢測的一種有效的方法m . avium無性係種群。副結核。本研究的目的是比較和驗證的實時PCR結果IS900-insertion序列和九個假定的序列作為診斷工具來檢測地圖。
菌株和增長
三個m . avium無性係種群。副結核緊張,(baa - 968年、19851年和43015年),六個non-MAP物種(m . fortuitum無性係種群。fortuitum, m . intracellulare m . kansasii m . marinum phlei,m . scrofulaceum臨床分離株)和13個地圖包括在這項研究中。地圖菌株和non-MAP物種從美國購買類型文化集合(寫明ATCC馬納薩斯,弗吉尼亞州)。臨床地圖菌株,分離出牛的糞便與自然獲得慢性細菌性腸炎,得到從Thompson-Bishop-Sparks狀態診斷實驗室,赤褐色,阿拉巴馬州。地圖是生長在Lowenstein-Jensen媒體(和公司正欲,火花,MD)和7 h9湯補充2毫克的Mycobactin (Difco實驗室、底特律、MI)。
DNA提取
PrepMan工具包(應用生物係統公司,卡爾斯巴德,CA)被用來從文化中提取DNA。簡而言之,樣本在中速離心機(3分鍾10000×g)在台式離心機顆粒細胞。上層清液被丟棄後,球團於100年被清洗和resuspendedµl PrepMan試劑。後短暫的渦流,混合物在100°C煮10分鍾。準備離心機,上層清液是用作PCR模板並存儲在-20°C,以供將來使用。PCR試驗之前,提取的DNA被量化nd - 1000分光光度計(NanoDrop威爾明頓·德·)。
實時聚合酶鏈反應
樣品製備,DNA提取、PCR混合組裝,和post-PCR分析進行實驗室在單獨的房間。從文化中提取DNA是量化和實時PCR。實時PCR試驗使用的執行三世超高速SYBR綠色QPCR大師混合(安捷倫科技,聖克拉拉,CA)。PCR目標IS900插入序列和其他九個假定的序列(AF503872 (Mptb52.1) AF503873 (Mptb52.16) AF503874 (Mptb52.6) AF503875 (Mptb54.16) AF503876 (Mptb54.24) AF503877 (Mptb54.33) AF503878 (Mptb55.15) AF503879 (Mptb61.32) AF503880 (Mptb62.12)]描述和存入基因庫(9、10)。
特定目標基因引物(表1)選擇從先前出版的文學和優化。單獨控製的反應混合物(負控製)和積極控製包含一個µl基因組DNA的參考m . avium無性係種群。副結核寫明ATCC baa(968年、19851年和43015年)。融化曲線輪廓進行確認和常規凝膠分析PCR正值的結果。所有實時PCR檢測進行至少在重複使用Stratagene Mx3000P®實時PCR儀(Stratagene拉霍亞,CA)。
| 加入(定義) | 引物序列(5 ' 3 ') | 擴增子大小(bp) | 開始端位置: | 參考年代 |
| AF503872 (Mptb52.1) | F -ATCCGGTGGATCGTCTCGC R -CATCGATTGACGTCCTCACC |
371年 | 3332937 - 3333307 | [9] |
| AF503873 (Mptb52.16) | F -ACGACAACGACCACACTCC R -CACAGGACACTCCATCAGG |
396年 | 3907417 - 3907812 | [9] |
| AF503874 (Mptb52.6) | F -ATCAACAAGACGTGCGCG R -CAGTGGTGCGCATGAAGTC |
266年 | 3327332 - 3327597 | [9] |
| AF503875 (Mptb54.16) | F -CTTCAACTCGACAAGAGTCGT R -TCAGAAGCGCGACTGGACTT |
403年 | 3324756 - 3325158 | [9] |
| AF503876 (Mptb54.24) | F -GCATGAACAGCAACAGGACC R -TGCGGTGGTAGCAACTAGCC |
410年 | 1823028 - 1823437 | [9] |
| AF503877 (Mptb54.33) | F -GATCTCTACGTGATCAAGGAG R -CGTCGGACAGGCGTATGTAA |
415年 | 1823550 - 1823964 | [9] |
| AF503878 (Mptb55.15) | F -TTGGACGAACTTGGCGATGA R -GGTAATCGGAACCCTTAGCG |
546年 | 1825825 - 1826370 | [9] |
| AF503879 (Mptb61.32) | F -ACGACGTCGTCAGACACCTA R -CGTAGGGTATATCGGGTCAAG |
523年 | 29424 - 29946 | [9] |
| AF503880 (Mptb62.12) | F -CTTGATCCTCGGGAGCGTG R -CTCCGACTGAATGAGCTGTG |
474年 | 4262495 - 4262968 | [9] |
| mHM172613 (IS900) | F -CCGCTAATTGAGAGATGCGATTGG R -AATCAACTCCAGCAGCGCGGCCTCG |
229年 | 4747310 - 4747538 | [10] |
| F -引物和R -反向引物。 | ||||
表1:特定的引物用於實時PCR擴增IS900和假定的序列與相應的擴增子的大小。
凝膠電泳
聚合酶鏈反應完成後,10µl實時PCR擴增反應的混合GelRed (Biotium,海沃德,CA)混合物和電泳三羥甲基氨基甲烷- acetate-EDTA緩衝液通過2%的瓊脂糖凝膠。樂隊合適大小的確定與DNA梯相比(羅氏分子生化藥劑,印第安納波利斯)。
在網上聚合酶鏈反應
在網上PCR(虛擬PCR)進行從序列數據庫與選定對PCR引物,使用一個索引策略,快速的性能。虛擬PCR被認為有較高的緊縮[11]。
證實了引物的特異性在網上PCR擴增65分枝杆菌物種。在網上聚合酶鏈反應序列數據庫搜索與一對PCR引物,使用索引策略快速的性能。PCR模擬是對最新的執行順序分枝杆菌基因組最多允許2引物和模板之間的不匹配,因此,嚴格的在網上PCR必須考慮高。目前所有的分枝杆菌物種序列數據(表2)檢查對選中的引物。
| S.No | 分枝杆菌物種 | 菌株 |
| 1。 | 膿腫分枝杆菌 | 寫明ATCC 19977 |
| 2。 | 膿腫分枝杆菌無性係種群。bolletii | 50594年 |
| 3所示。 | 分枝杆菌africanum | GM041182 |
| 4所示。 | 鳥型分支杆菌 | 104年 |
| 5。 | 分枝杆菌鳥結核無性係種群。副結核 | MAP4 |
| 6。 | 鳥型分支杆菌無性係種群。副結核str。 | k10 |
| 7所示。 | 牛結核分枝杆菌卡介苗str。 | 韓國1168便士 |
| 8。 | 牛結核分枝杆菌卡介苗str。 | 墨西哥 |
| 9。 | 牛結核分枝杆菌卡介苗str。 | 1173年巴斯德p2 |
| 10。 | 牛結核分枝杆菌卡介苗str。 | 東京172 |
| 11。 | 牛結核分枝杆菌無性係種群。寶 | AF2122/97 |
| 12。 | 分枝杆菌canettii | CIPT 140010059 |
| 13。 | 分枝杆菌canettii | CIPT 140060008 |
| 14。 | 分枝杆菌canettii | CIPT 140070008 |
| 15。 | 分枝杆菌canettii | CIPT 140070010 |
| 16。 | 分枝杆菌canettii | CIPT 140070017 |
| 17所示。 | 分枝杆菌chubuense | NBB4 |
| 18歲。 | 分枝杆菌gilvum | PYR-GCK |
| 19所示。 | 分枝杆菌indicus pranii | MTCC 9506 |
| 20. | 分枝杆菌intracellulare | 寫明ATCC 13950 |
| 21。 | 分枝杆菌intracellulare | MOTT-02 |
| 22。 | 分枝杆菌intracellulare | 莫特- 64 |
| 23。 | 分枝杆菌kansasii | 寫明ATCC 12478 |
| 24。 | 麻風杆菌 | Br4923 |
| 25。 | 麻風杆菌菌株 | TN |
| 26歲。 | 分枝杆菌liflandii | 128年fxt |
| 27。 | 分枝杆菌marinum | 米 |
| 28。 | 分枝杆菌massiliense str。 | 去06 |
| 29。 | 分枝杆菌neoaurum | VKM ac - 1815 d |
| 30. | 分枝杆菌rhodesiae | NBB3 |
| 31日。 | 分枝杆菌smegmatis | JS623 |
| 32。 | 分枝杆菌smegmatis str。 | MC2 155 |
| 33。 | 分枝杆菌smegmatis str。 | MC2 155 |
| 34。 | 分枝杆菌sp。 | JDM601 |
| 35。 | 分枝杆菌sp。 | JLS |
| 36。 | 分枝杆菌sp。 | 公裏 |
| 37歲。 | 分枝杆菌sp。 | MCS |
| 38。 | 分枝杆菌sp。 | MOTT36Y |
| 39歲。 | 分枝杆菌sp。 | Spyr1 |
| 40。 | 結核分枝杆菌 | 7199 - 99 |
| 41歲。 | 結核分枝杆菌 | 中科院NITR204 |
| 42。 | 結核分枝杆菌 | CCDC5079 |
| 43。 | 結核分枝杆菌 | CCDC5079 |
| 44歲。 | 結核分枝杆菌 | CCDC5180 |
| 45歲。 | 結核分枝杆菌 | CDC1551 |
| 46歲。 | 結核分枝杆菌 | CTRI-2 |
| 47歲。 | 結核分枝杆菌 | EAI5 |
| 48。 | 結核分枝杆菌 | EAI5 NITR206 |
| 49。 | 結核分枝杆菌 | 季 |
| 50。 | 結核分枝杆菌 | H37Ra |
| 51。 | 結核分枝杆菌 | H37Rv |
| 52歲。 | 結核分枝杆菌 | H37Rv |
| 53歲。 | 結核分枝杆菌 | 我們1435年 |
| 54。 | 結核分枝杆菌 | 我們4207年 |
| 55。 | 結核分枝杆菌 | 我們605年 |
| 56。 | 結核分枝杆菌 | RGTB327 |
| 57。 | 結核分枝杆菌 | RGTB423 |
| 58歲。 | 結核分枝杆菌 | UT205 |
| 59。 | 結核分枝杆菌str。北京 | NITR203 |
| 60。 | 結核分枝杆菌Erdman str | =寫明ATCC 35801 DNA |
| 61年。 | 結核分枝杆菌str,哈勒姆 | |
| 62年。 | 結核分枝杆菌str,哈勒姆 | NITR202 |
| 63年。 | 潰瘍分枝杆菌 | Agy99 |
| 64年。 | 分枝杆菌vanbaalenii | PYR-1 |
| 65年。 | 分枝杆菌yongonense | 05 - 1390 |
表2:分枝杆菌株驗證使用虛擬在網上PCR擴增。表1中列出了相應的引物。
完成地圖基因組序列的可用性支持更具體的診斷的識別序列(12、13)。序列數據庫的可用性帶來清晰的發病機理尚未解決的問題地圖在動物和人類,也促進了檢測設備的發展。針對重複序列PCR的引入像IS900插入元素,存在於多個副本的地圖基因組,據報道,以減少所需的時間和勞力地圖檢測[10]。本研究的主要目標是評估和優化的特異性PCR進行地圖目標分子檢測插入序列IS900和其他重複序列uniplex和/或多重PCR檢測地圖。驗證IS900插入序列和重複性/假定的序列,選擇合適的引物/采用實時PCR和和驗證在網上PCR。
實時聚合酶鏈反應
在這項研究中,優化了實時PCR的特異性檢測基因組DNA的分析不同的麵板分枝杆菌物種包括三個地圖參考菌株,牛13地圖臨床分離菌和六個non-MAP隔離。基因組DNA樣本受到PCR檢測針對IS900插入序列和額外的9個假定的序列對地圖和non-MAP文化uniplex以及多路複用平台。結果表明,IS900和假定的sequence-specific底漆對放大隻有從基因組DNA提取的地圖參考菌株和臨床分離株。如圖1所示,沒有放大nonMAP菌株(m . fortuitum無性係種群。fortuitum, m . intracellulare m . kansasii m . marinum m . phlei和m . scrofulaceum)。在凝膠,擴增子從地圖在預期的分子量和沒有檢測到信號non-MAP物種(圖2)。Uniplex IS900插入序列和/或複合pcr和假定的序列顯示單個或兩個截然不同的擴增子的存在,分別(圖2)。較低的樂隊代表了IS900序列擴增子(229個基點),和頂級樂隊代表擴增子從Mptb52.1(371個基點)。
圖2:PCR擴增IS900 Mptb52.6,假定的序列,m . avium無性係種群。副結核. .PCR產品受到1.5%瓊脂糖凝膠電泳和放大產品被凝膠電泳驗證。(一)巷1,低質量階梯DNA;通道2、3和8 PCR產物IS900插入序列;Mptb52.6車道4 & 5、PCR產物;道6 & 7,放大double-PCR產品針對IS900 & Mptb52.16序列。
在網上PCR分析
這個虛擬模擬PCR對最新的序列分枝杆菌基因組數據庫中。總共23分枝杆菌仕達屋優先計劃和65株驗證對IS900插入序列和其他9個重複序列(表2)。虛擬PCR結果表明IS900和假定的sequence-specific底漆對僅從地圖放大的具體目標。此外,在網上仿真結果表明,所有的引物選擇為每個IS900段和假定的序列隻放大地圖樣本,而不是從任何non-MAP物種。擴增子的大小是在預期範圍出版文獻和未發現二次樂隊(圖3)。
圖3:在網上目標引物PCR擴增結果(10 65地圖和non-MAP分枝杆菌菌株。分枝杆菌菌株列為5號(鳥型分支杆菌無性係種群。副結核MAP4)和6號(鳥型分支杆菌無性係種群。副結核str. k10)被放大(參見表2分枝杆菌spp。列表)。
一般來說幾個PCR檢測化驗了m . avium無性係種群。副結核(14、15)。幾項研究中使用的最突出的目標檢測的DNAm . avium無性係種群。副結核通過PCR是插入元素IS900 [15 - 17]。multicopy(17張)IS900序列的性質m . avium無性係種群。副結核染色體使它理想作為目標序列檢測的地圖,因為它表現出更高層次的敏感性比使用singlecopy基因目標(18、19)。
IS900診斷的特異性PCR,然而,還質疑,一些報告顯示IS900-like序列的存在分枝杆菌地圖以外的物種可能增加假地圖積極成果的風險(20、21)。Rajeev et al。(2005)報道了隔離non-MAP之一分枝杆菌株陽性IS900聚合酶鏈式反應的技術,這項技術尚未輸入[22]。
一些報道稱,假陰性PCR結果可能出現的問題困難的健壯的細胞壁的破壞地圖和堅持機械破壞步驟可能需要確保DNA地圖的最大釋放細胞存在於組織樣本。高效過程釋放的DNA可能因此PCR檢測靈敏度最大化[10]。
一般來說,IS900插入sequencetargeted的診斷性能檢測技術由於各種因素可能是有限的或誤解。這些包括隔離organism-specific DNA;樣本的來源;缺乏選擇合適的引物;PCR擴增的存在抑製物質在首選臨床標本;同時並發的存在分枝杆菌物種(1、15)。此外,可能的解釋為宿主-病原體相互作用,這種異質性可能主機映射菌株和病原體的偏好適應環境因素[10]。根據樣品測試和概述的方法在我們的研究中,IS900和額外的9個假定的序列是特定於使用PCR uniplex和/或複合應用程序。
這項工作是由美國農業部的支持格蘭特(美國農業部/短劍,加入0203750)和美國農業部研究所/ NIFA格蘭特(# 2011-51110-31082)。我們要感謝Sircy摩爾博士和細菌學Thompson-Bishop-Sparks狀態診斷實驗室的工作人員,赤褐色,艾爾。我們承認大衛博士Nganwa編輯支持和塔斯基吉大學獸醫學院(CVM)卓越中心(格蘭特# 245 5 d34hp00001-20-00)塔斯基吉大學共享儀器核心設備是由國立衛生研究院/ NIMHD格蘭特G12MD007585。夏季研究支持。
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文章類型:研究文章
引用:Yehualaeshet T,格雷厄姆M,塞繆爾·T,莫頓爵士,Rodning年代,et al。(2017)比較和驗證IS900-Sequence和假定的序列的特定目標檢測鳥結核分枝杆菌無性係種群。副結核。J動畫Sci Res 1 (1): doi 6457.101 http://dx.doi.org/10.16966/2576
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